腎小管上皮細(xì)胞缺氧狀況下細(xì)胞外基質(zhì)代謝特點(diǎn)初步解析.pdf

1、背景及目的：
　　細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度產(chǎn)生和降解減少是腎小管基底膜增厚的根本原因，但內(nèi)在機(jī)制尚未完全研究清楚，如果能掌握細(xì)胞外基質(zhì)代謝相關(guān)基因活動(dòng)全貌將有助于闡明內(nèi)在規(guī)律?；|(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase2，MMP-2）是降解基底膜膠原的關(guān)鍵酶。體外研究發(fā)現(xiàn)，缺氧抑制腎小管上皮細(xì)胞MMP-2活性。然而，缺氧為什么引起MMP-2活性下降？調(diào)控機(jī)制至今仍未研究清楚。
　　方法：
　　1.缺氧腎

2、小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
　　用RNA測(cè)序方法，分別檢測(cè)缺氧和常氧處理的腎小管上皮細(xì)胞整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的變化。
　　2.缺氧狀況下，分別上調(diào)和下調(diào)自噬與內(nèi)吞RAB7、自噬和內(nèi)吞特異性抑制劑、自噬和內(nèi)吞關(guān)鍵蛋白下調(diào)對(duì)MMP-2活性、表達(dá)和活性調(diào)節(jié)蛋白的影響。
　　首先構(gòu)建上調(diào)和下調(diào)RAB7基因載體;再用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和菲律平(filipin)分別處理細(xì)胞;接著下調(diào)自噬(Beclin-1)和內(nèi)吞（Caveolin-1）

3、的關(guān)鍵分子。用Zymography法分別測(cè)上清MMP-2活性;qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-2表達(dá);ELISA方法測(cè)培養(yǎng)上清MMP-2和Ⅳ型膠原蛋白含量;Western blotting檢測(cè)酶活性調(diào)節(jié)蛋白MMP-14、RECK、TIMP-2表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.缺氧腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
　　獲得2倍上調(diào)、下調(diào)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水平P＜0.05的基因共279個(gè)。與腎臟病相關(guān)的上調(diào)基因主要為:細(xì)胞外基質(zhì)與受體相互作

4、用、腎細(xì)胞癌、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等;與腎臟病相關(guān)的下調(diào)基因主要為:抗原處理和遞呈、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白處理、能量產(chǎn)生、谷胱甘肽生成等。此外，還檢測(cè)到缺氧細(xì)胞有51387選擇性剪接、常氧細(xì)胞有49144選擇性剪接和新轉(zhuǎn)錄組9394個(gè)以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)69706個(gè)。
　　2.缺氧狀況下，上調(diào)和下調(diào)自噬和內(nèi)吞共享分子RAB7對(duì)MMP-2活性、表達(dá)和活性調(diào)節(jié)蛋白的影響
　　缺氧腎小管上皮細(xì)胞在上調(diào)RAB7基因的表達(dá)后，培

5、養(yǎng)上清中MMP-2活性下降（缺氧+RAB7組:0.10±0.06;缺氧組:0.48±0.07，P＜0.01）、MMP-2 mRNA表達(dá)水平下降(缺氧+RAB7組:0.81±0.08;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.01)、MMP-2蛋白含量減少（缺氧+RAB7組:2.52±0.26μg/L;缺氧組:3.81±0.13μg/L，P＜0.01）、Ⅳ型膠原蛋白含量升高（缺氧+RAB7組:5.65±0.20μg/L;缺氧組:5.43±0.1

6、7μg/L，P＞0.05）;下調(diào)RAB7基因的表達(dá)，MMP-2活性明顯升高（缺氧+RAB7shRNA組:1.00±0.08;缺氧組:0.48±0.07，P＜0.01）、MMP-2mRNA表達(dá)升高（缺氧+RAB7shRNA組:3.80±0.23;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.01）、MMP-2蛋白含量增加（缺氧+RAB7 shRNA組:4.31±0.30μg/L;缺氧組:3.81±0.13μg/L，P＜0.05）、Ⅳ型膠原蛋白含量減

7、少(缺氧+RAB7shRNA組:5.01±0.20μg/L;缺氧組:5.43±0.17μg/L，P＜0.01)。
　　缺氧腎小管上皮細(xì)胞上調(diào)RAB7基因的表達(dá)，酶活性調(diào)節(jié)蛋白TIMP-2和MMP-14表達(dá)下降;下調(diào)RAB7基因的表達(dá)，TIMP-2和MMP-14蛋白表達(dá)升高。與缺氧組相比，無(wú)論上調(diào)還是下調(diào)RAB7基因表達(dá)，酶活性調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ECK表達(dá)均下降;下調(diào)RAB7表達(dá)之后，RECK表達(dá)下降尤其明顯（P＜0.01）。
　　3

8、.缺氧狀況下，自噬和內(nèi)吞特異性抑制劑對(duì)MMP-2活性、表達(dá)和活性調(diào)節(jié)蛋白的影響
　　在缺氧條件下抑制自噬，培養(yǎng)上清MMP-2活性有所降低（缺氧+3-MA組:0.25±0.04;缺氧組:0.36±0.07，P＞0.05）、MMP-2 mRNA表達(dá)水平大幅提升(缺氧+3-MA組:15.53±2.12;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.01)、MMP-2蛋白含量無(wú)顯著變化（缺氧+3-MA組:3.67±0.20μg/L;缺氧組:3.71

9、±0.12μg/L，P＞0.05）、Ⅳ型膠原蛋白含量略增加（缺氧+3-MA組:5.46±0.061μg/L;缺氧組:5.33±0.14μg/L，P＞0.05）;抑制內(nèi)吞能顯著恢復(fù)MMP-2活性（缺氧+filipin組:0.60±0.08;缺氧組:0.36±0.07，P＜0.01）、MMP-2 mRNA表達(dá)上調(diào)（缺氧+filipin組:6.40±2.22;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.01）、MMP-2蛋白含量顯著增加（缺氧+fil

10、ipin組:4.44±0.31μg/L;缺氧組:3.71±0.12μg/L，P＜0.05）、Ⅳ型膠原蛋白含量有所下降（缺氧+ filipin組:5.18±0.02μg/L;缺氧組:5.33±0.14μg/L，P＞0.05）。
　　在缺氧情況下3-MA、filipin均抑制TIMP-2的表達(dá)，而3-MA抑制效果更明顯。3-MA和filipin都抑制RECK的表達(dá)。filipin對(duì)MMP-14的表達(dá)水平有明顯上調(diào)作用。用免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)

11、證調(diào)控分子的變化，所得結(jié)果一致。
　　4.缺氧狀況下，自噬和內(nèi)吞關(guān)鍵蛋白下調(diào)對(duì)MMP-2活性、表達(dá)和活性調(diào)節(jié)蛋白的影響
　　缺氧情況下干擾Bec-1基因表達(dá)，培養(yǎng)上清MMP-2活性有所降低（缺氧+Bec-1shRNA組:0.35±0.17;缺氧組:0.49±0.02，P＞0.05）、MMP-2 mRNA表達(dá)水平升高（缺氧+Bec-1shRNA組:2.00±0.03;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.05）、MMP-2蛋白含

12、量無(wú)顯著變化（缺氧+Bec-1shRNA組:3.30±0.18μg/L;缺氧組:3.54±0.20μg/L，P＞0.05）、Ⅳ型膠原蛋白含量亦無(wú)顯著變化（缺氧+Bec-1 shRNA組:5.45±0.28μg/L;缺氧組:5.30±0.20μg/L，P＞0.05）;干擾Cav-1基因表達(dá)，培養(yǎng)上清MMP-2活性升高（缺氧+Cav-1 shRNA組:0.66±0.05;缺氧組:0.49±0.02，P＜0.01）、MMP-2 mRNA表達(dá)水

13、平顯著升高（缺氧+Cav-1 shRNA組:15.80±3.11;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.01）、MMP-2蛋白含量顯著增加（缺氧+Cav-1 shRNA組:4.15±0.26μg/L;缺氧組:3.54±0.20μg/L，P＜0.01）、Ⅳ型膠原蛋白含量有所減少（缺氧+Cav-1 shRNA組:4.90±0.60μg/L;缺氧組:5.30±0.20μg/L,P＞0.05）。
　　缺氧狀況下下調(diào)Bec-1基因或Cav-1

14、基因表達(dá)，均能抑制TIMP-2的表達(dá)，Bec-1shRNA的抑制效果比Cav-1 shRNA抑制效果明顯。MMP-14的表達(dá)和T1MP-2的表達(dá)情況相似。下調(diào)Beclin-1基因或Cav-1基因表達(dá)，均能抑制RECK表達(dá)，Bec-1shRNA抑制效果遜于Cav-1shRNA。
　　結(jié)論：
　　1.結(jié)果提示，缺氧狀況下，損傷修復(fù)相關(guān)基因活動(dòng)明顯增強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加;抗原處理和遞呈相關(guān)基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白處理相關(guān)基因、能量產(chǎn)生

15、相關(guān)基因、谷胱甘肽生成相關(guān)基因下調(diào)，提示缺氧使細(xì)胞抗損傷能力下降;腎細(xì)胞癌相關(guān)基因上調(diào)提示慢性腎臟病患者腎細(xì)胞癌發(fā)病率升高可能與腎組織缺氧有關(guān)。
　　2.從多角度證明，缺氧腎小管上皮細(xì)胞自噬與內(nèi)吞影響MMP-2的表達(dá)或活性。自噬主要抑制MMP-2mRNA表達(dá);而內(nèi)吞則主要抑制MMP-2活性。
　　3.缺氧腎小管上皮細(xì)胞Cav-1介導(dǎo)的內(nèi)吞、RECK表達(dá)增加、TIMP-2和MMP-14表達(dá)下降均影響MMP-2活性，其中Cav-