SSL5-PMPs促進(jìn)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　心血管疾病是全世界居首位的死亡原因，其最主要的病因是動(dòng)脈粥樣硬化。動(dòng)脈粥樣硬化的本質(zhì)是由多種因素引起的血管慢性炎癥，其中病原體的多重感染，即“感染負(fù)荷(infectious burden)”，被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化新的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。感染因素可通過(guò)直接作用、觸發(fā)全身性炎癥和啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)等多種方式對(duì)動(dòng)脈壁造成損害，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，其中病原體激活血小板所導(dǎo)致的血管炎癥和血栓形成具有重要作用。金黃色葡萄球菌（St

2、aphylococcus aureus,S.aureus）是臨床常見(jiàn)的致病菌之一。有研究顯示，血行感染S.aureus會(huì)增加急性心肌梗死和腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)，但機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為可能與血小板激活、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)以及血液的高凝狀態(tài)有關(guān)。本課題小組前期研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白-5(Staphylococcalsuperantigen-like protein5，SSL5)可以激活血小板，一次性靜脈注射SSL5還可導(dǎo)致小鼠肺動(dòng)脈內(nèi)形成

3、血栓。血小板不僅在血栓和止血的過(guò)程中發(fā)揮作用，同時(shí)還是重要的免疫和炎癥細(xì)胞，其可以通過(guò)激活產(chǎn)生的微?；蚺c白細(xì)胞相互作用導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。因此，推測(cè)SSL5可能通過(guò)激活血小板而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，探討其機(jī)制可以為闡明感染負(fù)荷在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　方法:
　　1.采用流式細(xì)胞術(shù)，鑒定重組SSL5的生物學(xué)活性，檢測(cè)外周血中PMPs數(shù)量以及SSL5激活的PMPs(SSL5-PMPs)表面分子的特征;利用掃描電鏡觀察SS

4、L5-PMPs的形態(tài)學(xué)特征;體外制備SSL5-PMPs以及ADP激活的PMPs(ADP-PMPs)和凋亡產(chǎn)生的PMPs(ap-PMPs)，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的刺激物和對(duì)照。
　　2.以人外周血單核細(xì)胞及THP-1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用CCK-8法檢測(cè)SSL5對(duì)單核細(xì)胞活力的影響;掃描電鏡觀察SSL5-PMPs與單核細(xì)胞的結(jié)合，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)兩者結(jié)合的時(shí)效關(guān)系和差異性;以產(chǎn)生炎癥介質(zhì)（細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶）及發(fā)生遷移作

5、為單核細(xì)胞炎癥效應(yīng)的指標(biāo)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)炎癥介質(zhì)mRNA的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子及趨化因子釋放的數(shù)量，明膠酶譜法檢測(cè)蛋白酶的活性，transwell遷移試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移。同時(shí)一并觀察對(duì)照PMPs(ADP-PMPs及ap-PMPs）和SSL5對(duì)單核細(xì)胞炎癥介質(zhì)mRNA表達(dá)的影響，以探討PMPs致單核細(xì)胞炎癥效應(yīng)的差異性及SSL5可能的病理作用。
　　3.以THP-1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用中和性抗體干擾SSL5-PMPs

6、與THP-1細(xì)胞間CD40L/CD40和P-選擇素/PSGL-1的結(jié)合，觀察其對(duì)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及遷移的影響，以明確介導(dǎo)SSL5-PMPs與THP-1細(xì)胞發(fā)生相互作用的分子基礎(chǔ);利用siRNA沉默THP-1細(xì)胞CD40或TRAF6的基因表達(dá)，觀察其對(duì)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響，同時(shí)采用Western blot和細(xì)胞免疫熒光等方法檢測(cè)NFκB磷酸化及核轉(zhuǎn)位的情況，以明確THP-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的胞內(nèi)信號(hào)通路;進(jìn)一步利用抑

7、制劑阻斷TLR-4信號(hào)通路，了解其對(duì)SSL5-PMPs促進(jìn)THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.SSL5激活人血小板并產(chǎn)生血小板微粒(SSL5-PMPs)。
　?、僦亟MSSL5具有生物學(xué)活性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);
　?、赟SL5導(dǎo)致人外周血中PMPs的數(shù)量明顯增加;
　?、跾SL5-PMPs的直徑為0.1～1μm，PS外暴露于膜表面，表達(dá)血小板特異性的糖蛋白GPIIb以及與細(xì)胞間相互作用的信號(hào)分子

8、P-選擇素和CD40L。
　　2.SSL5-PMPs促進(jìn)人單核細(xì)胞的致炎癥效應(yīng)。
　?、賁SL5不影響THP-1細(xì)胞的活力，排除因SSL5毒性作用而導(dǎo)致單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng);
　　②SSL5-PMPs與THP-1細(xì)胞的結(jié)合呈時(shí)間依賴性，且主要與外周血CD14++CD16+（中間型）的單核細(xì)胞結(jié)合;
　?、跾SL5-PMPs時(shí)間和劑量依賴性的促進(jìn)單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，包括表達(dá)和釋放IL-1β和TNFα、MCP-1以

9、及MMP-9，并增強(qiáng)MMP-9的活性;
　?、蹵DP-PMPs和ap-PMPs也可以促進(jìn)THP-1細(xì)胞炎癥介質(zhì)mRNA的表達(dá)，其水平低于SSL5-PMPs刺激的結(jié)果，而SSL5對(duì)THP-1細(xì)胞炎癥介質(zhì)mRNA的表達(dá)沒(méi)有影響;
　?、軸SL5-PMPs促進(jìn)MCP-1誘導(dǎo)的單核細(xì)胞發(fā)生遷移，而SSL5則抑制遷移;
　　3.SSL5-PMPs促進(jìn)人單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制。
　?、僮钄郈D40L與CD40的相互作用，可以

10、部分抑制SSL5-PMPs誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，而抑制P-選擇素與PSGL-1的相互作用則對(duì)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生沒(méi)有影響;
　　②阻斷PSGL-1導(dǎo)致SSL5-PMPs介導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移幾乎完全被抑制，而抑制CD40L與CD40的相互作用則明顯減少單核細(xì)胞遷移的比率;
　?、巯抡{(diào)單核細(xì)胞CD40或TRAF6基因的表達(dá)，導(dǎo)致SSL5-PMPs誘導(dǎo)單核細(xì)胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生減少，并抑制NFκB p65亞單位的磷酸化及核轉(zhuǎn)位;
　

11、?、茏钄郥LR4信號(hào)通路對(duì)SSL5-PMPs誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)沒(méi)有影響。
　　結(jié)論:
　　SSL5，S.aureus分泌的一種毒素可以激活血小板并產(chǎn)生PMPs(SSL5-PMPs)，導(dǎo)致外周血中的PMPs數(shù)量明顯增加;SSL5-PMPs與單核細(xì)胞結(jié)合，且主要與外周血中的具有促炎功能的中間型單核細(xì)胞結(jié)合，并促進(jìn)單核細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的炎癥反應(yīng)，包括增加炎性細(xì)胞因子和趨化因子的釋放、增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性以及誘導(dǎo)遷移;在機(jī)制方