嗜酸乳桿菌對(duì)重型顱腦損傷小鼠小腸鈣敏感通路影響的研究.pdf

1、重型顱腦損傷(Severe head injury，SHI)所致的腸動(dòng)力不足具有發(fā)生早、程度重、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，其發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重影響傷情轉(zhuǎn)歸及預(yù)后。腸動(dòng)力不足不僅嚴(yán)重限制了早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的順利實(shí)施，而且若得不到有效改善后期容易導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良、誤吸、細(xì)菌移位甚至誘發(fā)MODS等嚴(yán)重并發(fā)癥。促進(jìn)胃腸功能的恢復(fù)能有效阻斷MODS進(jìn)一步發(fā)展，因此積極糾正重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足有益于患者預(yù)后和疾病轉(zhuǎn)歸。腸道收縮的基本單位是平滑肌細(xì)胞(smooth m

2、uscle cell，SMC)，其中20 kD肌球蛋白輕鏈(20 kD of myosin light chain，MLC20)是調(diào)控平滑肌收縮的重要結(jié)構(gòu)域，其絲氨酸第19號(hào)位點(diǎn)與磷酸基團(tuán)(Pi)結(jié)合后發(fā)生磷酸化，引起粗細(xì)肌絲間相對(duì)移位，拉動(dòng)細(xì)胞發(fā)生收縮。基礎(chǔ)研究表明，MLC20磷酸化過(guò)程受多重信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控，鈣依賴(lài)性通路/鈣敏感通路是其中的兩條主要途徑，肌球蛋白輕鏈的磷酸酶(myosin light chainphosphatase，M

3、LCP)結(jié)構(gòu)中活性亞基MYPT1(Myosin phosphatase target subunit1)的磷酸化過(guò)程是鈣敏感通路的核心環(huán)節(jié)，受到通路上游Rho相關(guān)激酶(Rho-associatedkinase，ROCK)及Zipper相互作用蛋白激酶(Zipper-interacting protein kinase，ZIPK)等信號(hào)的聯(lián)合調(diào)控，參與多種胃腸動(dòng)力障礙疾病的發(fā)生發(fā)展，然而該通路是否與重型顱腦損傷后腸道動(dòng)力不足有關(guān)，尚不清楚

4、。目前臨床針對(duì)重癥患者出現(xiàn)的腸動(dòng)力不足多采用藥物治療，但藥物產(chǎn)生的副作用還會(huì)加重病情。嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidphilus，La)可幫助改善功能性胃腸病、手術(shù)、感染等引起的胃腸動(dòng)力不足，且作用溫和。課題組前期發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌可改善重型顱腦損傷后小鼠腸傳輸率，調(diào)節(jié)傷后小腸離體肌條收縮頻率、幅度、張力的異常。結(jié)合前期研究和相關(guān)文獻(xiàn)，我們推測(cè):重型顱腦損傷可能導(dǎo)致腸道平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，鈣敏感通路傳導(dǎo)異常，進(jìn)而出現(xiàn)腸道收

5、縮的力量不足;La調(diào)節(jié)SHI后IMD的作用機(jī)制可能與修復(fù)傷后受損的平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)鈣敏感通路中相關(guān)信號(hào)的傳導(dǎo)有關(guān)。
　　目的：
　　本課題旨在研究重型顱腦損傷所致腸動(dòng)力不足產(chǎn)生的分子機(jī)制，選取嗜酸乳桿菌單菌進(jìn)行干預(yù)，觀測(cè)其對(duì)調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力信號(hào)中鈣敏感通路的影響，以進(jìn)一步明確重型顱腦損傷對(duì)胃腸功能的影響以及嗜酸乳桿菌的作用機(jī)制，以期為該類(lèi)益生菌在重癥創(chuàng)傷領(lǐng)域的合理應(yīng)用提供理論參考。
　　方法：
　　1.建立重型顱

6、腦損傷致腸動(dòng)力障礙小鼠模型將90只SPF級(jí)雄性C57bl/6小鼠隨機(jī)分為假傷組（對(duì)照組）、損傷組（SHI+MRS組）、La組（SHI+La組），各組又分別有1d、3d、7d三個(gè)時(shí)相點(diǎn)。采用方歡等改良的菲尼自由落體撞擊法，建立重型顱腦損傷后腸動(dòng)力障礙小鼠模型。對(duì)照的假傷組小鼠只打開(kāi)顱骨不進(jìn)行沖擊致傷。假傷組和損傷組每日在相同時(shí)間點(diǎn)，灌胃0.5ml MRS（La專(zhuān)用）培養(yǎng)基，La組灌胃等體積La混懸液（含菌量≥1×1010 cfu/d），各

7、組其余時(shí)間均自由飲食水。
　　2.采用末端回腸組織HE染色病理切片，觀察小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)等基本病理變化，測(cè)算平滑肌肌層厚度。
　　3.采用特異性生物素標(biāo)記的免疫組織化學(xué)染色法，檢測(cè)MLC20、MLC20磷酸化、MLCP、MYPT1亞基磷酸化信號(hào)表達(dá)與分布。
　　4.采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，檢測(cè)小鼠回腸組織內(nèi)MLCP表達(dá)量。
　　5.采用RT-PCR手段，檢測(cè)ROCK、ZIPK激酶基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：<

8、br>　　1.小腸組織病理及肌層厚度變化
　　HE染色結(jié)果顯示，假傷組小腸全層組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常;SHI組小鼠在1d、3d、7d時(shí)組織均出現(xiàn)明顯病理變化，并且隨時(shí)間進(jìn)一步加重，出現(xiàn)腸黏膜上皮局灶性壞死，形成潰瘍，腸黏膜屏障嚴(yán)重受損;肌層厚度明顯變薄(vs.假傷組，1d，3dP＜0.05，7d P＜0.01)。嗜酸乳桿菌干預(yù)7d后小腸絨毛形態(tài)、高度、絨毛中段直徑與假傷組無(wú)顯著區(qū)別，間質(zhì)無(wú)水腫及炎癥反應(yīng)，肌層未見(jiàn)明顯病理改變，厚度

9、正常。
　　2.MLC20及其磷酸化水平變化
　　免疫組化結(jié)果顯示，MLC20的表達(dá)在三組間無(wú)明顯差異。p-MLC20在SHI后1d、3d、7d的水平均明顯降低（vs.假傷組，P＜0.05）;嗜酸乳桿菌干預(yù)1d、3d、7d后p-MLC20顯著升高（vs.SHI組，P＜0.05）。
　　3.MLCP表達(dá)量與組織分布變化
　　ELISA結(jié)果顯示，MLCP表達(dá)量在SHI后1d、3d、7d的水平均顯著升高（vs.假傷組，

10、P＜0.01）;嗜酸乳桿菌干預(yù)1d、3d、7d后p-MLC20明顯降低(vs.SHI組，P＜0.05)。免疫組化結(jié)果與ELISA結(jié)果一致。
　　4.p-MYPT1組織分布變化
　　免疫組化結(jié)果顯示，p-MYPT1組織分布在SHI后1d、3d、7d均出現(xiàn)下降趨勢(shì)(vs.假傷組，P＜0.01）;嗜酸乳桿菌使用后使得1d、3d、7d的p-MYPT1表達(dá)升高(vs.SHI組，P＜0.01)。
　　5.ROCK基因水平變化

11、>　　PCR結(jié)果顯示，SHI后1d、3d、7d小腸組織ROCK基因表達(dá)均顯著降低（vs.假傷組，P＜0.01）。使用嗜酸乳桿菌1d后ROCK基因的表達(dá)即顯著升高(vs.SHI組，P＜0.05);干預(yù)3d和7d后均升高（vs.SHI組，P＜0.01）。
　　6.ZIPK基因水平變化
　　PCR結(jié)果顯示， SHI后1d、3d、7d小腸組織ZIPK基因表達(dá)均顯著降低（vs.假傷組，P＜0.01）。使用嗜酸乳桿菌1d和3d后ZIPK

12、基因的表達(dá)升高(vs.SHI組，P＜0.05);干預(yù)7d后顯著升高（vs.SHI組，P＜0.01）。并且在La組內(nèi)，不同時(shí)間點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足小鼠小腸組織呈現(xiàn)平滑肌肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞變性，胞核固縮，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫的組織病理學(xué)改變;同時(shí)出現(xiàn)小腸平滑肌肌層變薄。
　　2.重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足小鼠小腸組織中MYPT1磷酸化水平下降，MLCP表達(dá)量和活

13、性增加，腸道鈣敏感通路異常激活，MLC20磷酸化水平下降;同時(shí)出現(xiàn)ROCK與ZIPK基因表達(dá)水平下降。
　　3.嗜酸乳桿菌的干預(yù)使重型顱腦損傷后腸動(dòng)力不足的小鼠小腸組織病理狀態(tài)得到改善，平滑肌細(xì)胞受損程度減輕，肌層厚度增加。
　　4.使用嗜酸乳桿菌后可以上調(diào)重型顱腦損傷后小腸ROCK與ZIPK基因水平;增加MYPT1的磷酸化，降低MLCP表達(dá)量和分布水平，抑制腸道鈣敏感通路的過(guò)度激活，維持MLC20磷酸化水平。
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