大鼠椎間盤巢源性干細胞的特性鑒定及HGF-C-met介導(dǎo)其遷移-修復(fù)的研究.pdf

1、椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)的發(fā)生發(fā)展始于青少年時期，其引起的椎間盤退變性疾病發(fā)病率很高，并帶來諸如腰腿痛等一系列癥狀，會導(dǎo)致人們短期或永久的功能障礙，為家庭和社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。對于椎間盤退變性疾病，目前主要的治療方法還主要集中在保守治療和手術(shù)治療，無法從根源上解決IVDD問題。對于IVDD的生物學(xué)治療，目前的研究主要集中于外源性干細胞的移植修復(fù)，不可避免地帶來一些缺陷

2、或并發(fā)癥，一定程度上限制了其深入研究及推廣應(yīng)用。
　　隨著椎間盤內(nèi)干細胞巢(stem cell niches of the intervertebral disc，ISN)的發(fā)現(xiàn)及其干細胞遷移理論的提出，ISN內(nèi)源性干細胞(ISN-SCs)遷移至椎間盤內(nèi)部過程可能是椎間盤再生的一個重要潛在機制，關(guān)于促進ISN-SCs自體遷移-修復(fù)也逐漸成為研究IVDD生物學(xué)治療的新方向。但是目前尚缺乏關(guān)于椎間盤內(nèi)ISN-SCs體外特性鑒定及其遷移

3、-修復(fù)機制的相關(guān)研究，限制了ISN-SCs進行內(nèi)源性修復(fù)椎間盤這一新的生物學(xué)治療策略的發(fā)展。
　　肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)具有十分廣泛的生物學(xué)作用，可以通過與其受體MET原癌基因編碼的跨膜酪氨酸激酶(proto-oncogene MET codedtransmembrane receptor tyrosine kinase，c-met)相結(jié)合，介導(dǎo)多種細胞運動和增殖，促進腫瘤生長和

4、轉(zhuǎn)移，對造血細胞和多種干細胞的分化、粘附、遷移等也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。
　　基于以上理論基礎(chǔ)及研究現(xiàn)狀，本研究擬采用大鼠作為實驗動物，體外分離、培養(yǎng)ISN-SCs，從細胞多向分化能力、干細胞基因等方面與骨髓源性間充質(zhì)干細胞(bonemarrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)進行比較，對其特性進行鑒定;制造髓核細胞(nucleus pulposus cells，NPCs)衰老模型，從蛋白

5、和基因水平明確ISN-SCs對衰老NPCs的修復(fù)能力;探索HGF/c-met介導(dǎo)ISN-SCs遷移的相關(guān)分子機制;為HGF在椎間盤修復(fù)研究領(lǐng)域的應(yīng)用以及進一步深入研究椎間盤ISN-SCs內(nèi)源性遷移-修復(fù)效應(yīng)提供充分的理論和研究基礎(chǔ)，為IVDD的生物學(xué)治療開辟新的思路和方向——促進內(nèi)源性干細胞遷移。
　　第一部分 ISN-SCs的體外分離、培養(yǎng)和特性鑒定
　　目的:隨著ISN的發(fā)現(xiàn)及其理論的提出，ISN-SCs對椎間盤內(nèi)源性修

6、復(fù)作用也逐漸受到重視。然而，目前尚無相關(guān)體外研究對ISN-SCs進行分離、培養(yǎng)和特性鑒定，限制了對其展開深入研究。因此，充分地認識ISN-SCs可以為更好地理解椎間盤退變及再生過程。此研究的目的主要是體外證明ISN-SCs的存在，并比較其與BMSCs干細胞特性之間的差異，明確其特定的生物學(xué)性能。
　　方法:選用Sprague-Dawley大鼠（雄性，10周齡）作為研究對象。按照ISN的解剖區(qū)域（骺板外周軟骨膜區(qū)域），在解剖顯微鏡下

7、，采用眼科手術(shù)器械分離、獲取ISN組織，進一步Ⅱ型膠原酶消化獲取原代細胞群，貼壁培養(yǎng)并連續(xù)傳代后純化ISN-SCs;分離相同大鼠的股骨和脛骨，沖洗骨髓腔，采用密度梯度離心法獲取BMSCs，連續(xù)傳代純化。將第四代(P4)ISN-SCs和BMSCs用于進一步的分析比較，包括:克隆形成能力，細胞免疫表型，細胞周期，干細胞相關(guān)基因的表達水平，細胞增殖和三系分化（成骨、成軟骨、成脂肪）能力。
　　結(jié)果:ISN-SCs和BMSCs兩者均符合多

8、能間充質(zhì)干細胞的基本標準，具有貼壁能力、特定的干細胞表面抗原表達譜以及多向分化潛能;尤其是在成骨分化和成軟骨分化方面，ISN-SCs表現(xiàn)出較BMSCs更強的分化能力;此外，ISN-SCs還表達干細胞相關(guān)基因（與BMSCs干細胞相關(guān)基因表達水平相當(dāng)），具有較好的克隆形成能力和自我增殖更新能力。
　　結(jié)論:該研究成功體外分離、培養(yǎng)了ISN-SCs，并對其相關(guān)特性進行了鑒定。ISN-SCs屬于間充質(zhì)干細胞家族，與BMSCs相比具有更強的

9、成骨和成軟骨分化能力。這對于進一步深入研究ISN-SCs遷移至椎間盤內(nèi)部從而促進其內(nèi)源性修復(fù)具有重要的意義，同時也為椎間盤自我再生修復(fù)的研究提供了不同的生物學(xué)路徑和全新的視角。
　　第二部分 ISN-SCs對衰老NPCs的修復(fù)能力研究
　　目的:明確ISN-SCs對衰老NPCs的修復(fù)作用。
　　方法:分離、培養(yǎng)實驗動物（Sprague-Dawley大鼠，雄性，10周齡）的ISN-SCs和NPCs;采用連續(xù)傳代法制備NP

10、Cs衰老模型，并采用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase，SA-β-Gal)染色法檢測衰老模型的有效性;采用第四代(P4) ISN-SCs與衰老的NPCs接觸共培養(yǎng)(1∶1)一周后，采用甲苯胺藍染色檢測其蛋白聚糖表達水平，采用免疫組化檢測其Ⅱ型膠原蛋白表達水平，采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain react

11、ion，qPCR)檢測ACAN和COL2a1的mRNA表達水平，并分別與衰老NPCs對照組和正常NPCs對照組中的表達水平進行比較，鑒定ISN-SCs對衰老NPCs的修復(fù)作用。
　　結(jié)果:SA-β-Gal染色顯示連續(xù)傳代后NPCs衰老率逐漸增加，P3 NPCs未出現(xiàn)明顯的衰老（衰老率3.0±0.5％），P5 NPCs衰老率為18.3±0.7％（＜20％），P10NPCs衰老率為86.0±4.6％(＞80％)。與正常NPCs(P3)

12、相比，衰老NPCs(P10)的蛋白聚糖甲苯胺藍染色和II型膠原免疫組化染色強度減弱，ACAN和COL2a1的mRNA表達水平均顯著性降低(P＜0.05)。接觸共培養(yǎng)后，與衰老NPCs相比，共培養(yǎng)細胞體系中的蛋白聚糖甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色強度明顯增強恢復(fù)至正常水平，ACAN和COL2a1的mRNA表達水平均顯著性增加(P＜0.05)，且與正常NPCs相比無顯著性差異。
　　結(jié)論:采用連續(xù)傳代法可以制備有效的NPCs衰老模

13、型，P10NPCs即可達到衰老標準。ISN-SCs對衰老的NPCs具有良好的修復(fù)能力，可以進一步用于NPCs的修復(fù)研究。
　　第三部分 HGF/c-met介導(dǎo)的ISN-SCs遷移機制的研究
　　目的:進一步闡明HGF/c-met介導(dǎo)ISN-SCs遷移的細胞信號通路及相關(guān)分子機制。
　　方法:分離、培養(yǎng)實驗動物（Sprague-Dawley大鼠，雄性，10周齡）的ISN-SCs和NPCs;采用連續(xù)傳代法制備NPCs衰老模

14、型。采用免疫熒光(immunofluorescence，IF)及PCR技術(shù)，檢測并比較正常和衰老NPCs中HGF的蛋白及mRNA表達水平，并檢測ISN-SCs中受體c-met的蛋白和mRNA表達。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)分析比較正常和衰老NPCs中HGF的細胞外分泌水平。將c-met抑制劑K-252a作用于ISN-SCs后，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western b

15、lot，WB）檢測HGF對胞內(nèi)磷酸化蛋白激酶(p-Akt)蛋白表達水平的影響，并與對照組進行比較，明確HGF/c-met介導(dǎo)的胞內(nèi)PI3K/AKT途徑的激活。采用Transwell遷移體系，并通過各相關(guān)細胞內(nèi)外信號通路受體阻斷劑(K-252a，LY294002)的作用，明確HGF/c-met及其下游胞內(nèi)PI3K/AKT信號通路的阻斷對ISN-SCs遷移的影響。
　　結(jié)果:IF及PCR分析顯示，在ISN-SCs中，受體c-met的蛋

16、白和mRNA存在明顯的表達;與正常NPCs相比，衰老的NPCs中HGF的蛋白及mRNA表達水平顯著性下降(P＜0.05)。ELISA分析顯示，與正常NPCs相比，衰老的NPCs培養(yǎng)液中HGF的細胞外分泌水平顯著性下降(P＜0.05)。WB分析顯示，HGF可以顯著促進ISN-SCs胞內(nèi)p-Akt蛋白的激活表達(P＜0.05);而在K-252a作用于ISN-SCs而抑制其c-met受體后，該激活表達效應(yīng)受到抑制，p-Akt蛋白表達顯著性降低

17、(P＜0.05)。Transwell遷移實驗顯示，HGF可以顯著促進ISN-SCs遷移運動，增加其遷移的細胞數(shù)量(P＜0.05);而在各相關(guān)細胞內(nèi)外信號通路受體阻斷劑(K-252a，LY294002)的作用下，HGF的促遷移效應(yīng)明顯受到抑制，遷移的細胞數(shù)量顯著性減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:受體c-met廣泛表達于ISN-SCs，而配體HGF廣泛表達于NPCs;隨著NPCs的衰老，其HGF的表達和外分泌水平會明顯降低。而HGF

18、/c-met信號通路介導(dǎo)了胞內(nèi)PI3K/AKT途徑的激活，進而促進了ISN-SCs的遷移作用;因此，隨著IVDD的進展，退變椎間盤中衰老的NPCs對ISN-SCs的促遷移作用可能會減弱，這可能是IVDD進展惡化的一個重要原因之一。這為HGF在椎間盤修復(fù)研究領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了新的理論基礎(chǔ)——促進ISN-SCs內(nèi)源性遷移至椎間盤內(nèi)部;同時也為進一步尋找更為合適的促遷移趨化因子和靶點提供了充分的研究基礎(chǔ);為后續(xù)進行椎間盤中ISN-SCs遷移-修