黏蛋白-1激活AKT和ERK對非小細胞肺癌生物學特性影響.pdf

1、目的：
　　黏蛋白-1（Mucin1, MUC1）是一種跨膜的糖蛋白，MUC1蛋白在多種癌癥組織中都異常高表達，其中包括非小細胞肺癌（ non-small cell lung cancer, NSCLC）。已知新生血管的形成在腫瘤的發(fā)生、生長、浸潤和轉(zhuǎn)移四個過程中都具有非常重要的意義，腫瘤組織中內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是主要的促進新生血管形成機制。本課題旨在研究

2、MUC1和VEGF在NSCLC組織中表達的相關性，進一步研究過表達MUC1基因?qū)SCLC細胞生物學特征影響及其分子機制。
　　方法：
　　定量PCR檢測MUC1和VEGF mRNA在NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達；免疫組化法檢測MUC1和VEGF在100例NSCLC組織中的表達，分析二者的相關性。通過在A549和 NCI-H460細胞中轉(zhuǎn)染MUC1基因進而觀察過表達MUC1對NSCLC促血管生成的影響。逆轉(zhuǎn)錄PCR和蛋

3、白質(zhì)印跡法用于檢測轉(zhuǎn)染細胞中MUC1 mRNA和蛋白表達的情況。收集轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清，并與人靜脈內(nèi)皮細胞孵育，應用內(nèi)皮細胞遷移實驗和血管形成實驗研究過表達 MUC1對于 NSCLC細胞促內(nèi)皮細胞遷移和形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力的影響。通過 MTT實驗分析過表達 MUC1對 NSCLC細胞增殖的影響。應用克隆形成實驗分析分析MUC1基因過表達后NSCLC細胞克隆形成能力的影響。MUC1基因過表達后應用細胞粘附實驗檢測NSCLC細胞粘附于纖維連接

4、蛋白的能力；應用碘化丙啶染色法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測NSCLC細胞細胞周期分布情況。酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）研究轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清中的血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達。通過慢病毒載體系統(tǒng)建立穩(wěn)定MUC1基因過表達的A549細胞，通過MTT實驗和裸鼠荷瘤實驗分析MUC1對細胞增殖的影響。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測過表達MUC1基因?qū)偟囊约傲姿峄牡鞍准っ?B(PKB或 A

5、KT)、胞外信號調(diào)控激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路、p38以及c-Jun氨基末端激酶（ c-Jun N-terminal kinase，JNK）表達的影響。同時，應用ERK和AKT抑制劑PD9859和SH-5預處理 NSCLC細胞，觀察抑制ERK或者AKT的活化對血管形成的影響。
　　結(jié)果：
　　MUC1和 VEGF mRNA在 NSCLC癌組織中的表達明顯

6、高于癌旁組織。MUC1的表達與NSCLC腫瘤大小、組織學類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期都有統(tǒng)計學意義，但其陽性率與患者的年齡、性別、是否吸煙之間無統(tǒng)計學意義。VEGF的表達與NSCLC腫瘤大小、組織學類型、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和都有統(tǒng)計學意義，但其陽性率與患者的年齡、分化程度、是否吸煙、TNM分期之間無統(tǒng)計學意義。MUC1與VEGF的表達呈顯著正相關（r=0.380,p<0.01）。
　　RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MUC1基因

7、導致A549和 NCI-H460細胞 MUC1 mRNA表達增強。蛋白質(zhì)印跡法顯示，在轉(zhuǎn)染 MUC1基因的A549和 NCI-H460細胞中MUC1蛋白的表達量顯著增加。同時，RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗則顯示，在A549和 NCI-H460細胞中過表達MUC1能夠顯著增強VEGF的表達和分泌。在A549和 NCI-H460細胞中過表達MUC1能夠顯著增強依賴于血管內(nèi)皮細胞生長因子的內(nèi)皮細胞的遷移和小管的形成，應用 VEGF中和性抗體

8、可顯著逆轉(zhuǎn) MUC1誘導的內(nèi)皮細胞遷移和血管形成作用。過表達 MUC1對 A549和NCI-H460細胞周期分布以及粘附能力都沒有顯著影響。MUC1基因過表達能夠明顯促進細胞增殖和細胞克隆能力。動物實驗結(jié)果顯示 MUC1基因過表達后能夠顯著促進A549細胞移植瘤的生長，瘤重和瘤體積都明顯高于對照組。
　　蛋白質(zhì)印跡法檢測在過表達 MUC1基因的 A549和 NCI-H460細胞中總AKT、ERK、p38及JNK均沒有明顯的變化。但

9、是，過表達MUC1基因能夠顯著增強AKT和ERK的磷酸化，但是對p38和JNK的磷酸化均沒有明顯的影響。應用 ERK和 AKT抑制劑 PD9859和 SH-5預處理 NSCLC細胞可以顯著逆轉(zhuǎn)MUC1介導的促血管生成作用。
　　結(jié)論：
　　MUC1和VEGF在NSCLC組織中的表達明顯增高與NSCLC發(fā)生發(fā)展密切有關，且MUC1與VEGF的表達呈顯著正相關。在NSCLC細胞中，過表達MUC1基因可以誘導VEGF的表達和分泌，