一種新型人溶菌酶同源蛋白LYC1在畢赤酵母中的重組表達(dá)與發(fā)酵研究.pdf

1、溶菌酶在自然界有廣泛的分布，全稱(chēng)1,4-β-N-乙酰胞壁酸聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrolase)，簡(jiǎn)稱(chēng)胞壁酸酶或胞壁質(zhì)酶（muramidase）。溶菌酶作為一種先天非特異免疫防御因子，在機(jī)體對(duì)抗感染性病原菌中發(fā)揮重要作用。根據(jù)其物種來(lái)源以及結(jié)構(gòu)、分子量的不同可分為以下六種類(lèi)型:雞型溶菌酶(chicken type，c型);鵝型溶菌酶(geese type，g型);無(wú)脊椎動(dòng)物溶菌酶(inverte

2、brate type，i型);植物溶菌酶;微生物溶菌酶;噬菌體溶菌酶(phage type，p型)。C型溶菌酶是分布最廣泛也是唯一同時(shí)在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中存在的類(lèi)型，因此人們對(duì)c型溶菌酶的研究也最為深入。
　　LYC1(LYZL6)是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)和克隆的一個(gè)新的人c型溶菌酶家族基因。對(duì)LYC1蛋白序列的分析表明，它與人溶菌酶氨基酸序列上的一致性達(dá)到44％，并具有c型溶菌酶保守的8個(gè)Cys殘基以及Glu-35和Asp-52催化殘

3、基。
　　本研究通過(guò)建立和應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，依據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好特性人工合成了去除自身信號(hào)肽的LYC1基因序列，并構(gòu)建畢赤酵母α-因子信號(hào)肽引導(dǎo)表達(dá)具有天然N端LYC1的重組pPIC9k-LYC1分泌型畢赤酵母載體。將線(xiàn)性化重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌株GS115和SMD1168中，使其定點(diǎn)整合進(jìn)畢赤酵母基因組中。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)篩選以及多拷貝篩選，獲得穩(wěn)定整合表達(dá)載體的多拷貝插入菌株。通過(guò)搖瓶培養(yǎng)和誘導(dǎo)，篩選出表達(dá)能力強(qiáng)的重組菌株，

4、并優(yōu)化表達(dá)條件。進(jìn)一步在30L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵研究，通過(guò)控制發(fā)酵工藝如轉(zhuǎn)速、通氣量、甘油/甲醇流加方式、溫度、pH等參數(shù)以及添加補(bǔ)料，使蛋白表達(dá)量得到了提升，為接下來(lái)的純化工作提供了一定量的目標(biāo)蛋白。
　　SDS-PAGE顯示LYC1重組蛋白發(fā)酵上清呈現(xiàn)不均一性，可能是重組蛋白發(fā)生了降解、糖基化或聚集導(dǎo)致。對(duì)樣品的質(zhì)譜分析證實(shí)了LYC1的表達(dá)。GS115重組菌株蛋白表達(dá)量較SMD1168為少，這可能因?yàn)镚S115表達(dá)蛋白降解更為嚴(yán)