異種同源EGFR胞外段在畢赤巴斯德酵母中的表達(dá)及其抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是CerbB1/EGFR基因編碼的Src家族跨膜受體酪氨酸激酶，由胞外段，跨膜段及胞內(nèi)激酶活性段構(gòu)成。其胞外段的主要功能是結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子EGF等配體介導(dǎo)受體同源二聚化，或者與同族其它的受體如erbB2等異二聚化，進(jìn)而激活胞內(nèi)段酪氨酸激酶活性，啟動(dòng)EGFR通路信號(hào)傳遞。目前EGFR胞外段已成為EGFR陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤免疫治療的重要標(biāo)靶。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分子克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)異種同源表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR胞外段在畢赤巴

2、斯德酵母中的分泌性表達(dá)，并通過(guò)基因工程純化得到異種同源的重組EGFR蛋白疫苗，對(duì)家兔和荷瘤小鼠進(jìn)行免疫，探討以EGFR為靶向激發(fā)EGFR特異的抗腫瘤主動(dòng)免疫反應(yīng)的可行性。方法將鼠和人的EGFR胞外段目的基因(mer，her)與分泌型畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA重組，構(gòu)建了相應(yīng)的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-mer和pPICZαA-her，用SacI將重組質(zhì)粒線性化后，電穿孔轉(zhuǎn)化酵母菌株GS115，利用Zeocin篩選陽(yáng)性克隆，挑出陽(yáng)性克

3、隆用甲醇小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析及Western-blot檢測(cè)，篩選高表達(dá)量的克隆作大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)。分離純化得到重組蛋白EGFR，并用SDS-PAGE分析及Western-blot鑒定。在C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞hepal-6，建立小鼠肝癌模型，用重組蛋白EGFR與復(fù)方氫氧化鋁佐劑的混合物作為蛋白疫苗對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行免疫治療。并用重組蛋白mEGFR與復(fù)方氫氧化鋁佐劑的混合物免疫家兔，以制備大量兔抗鼠的抗體，為后

4、續(xù)裸鼠實(shí)驗(yàn)打基礎(chǔ)。結(jié)果獲得了鼠和人的EGFR胞外段目的蛋白在畢赤巴斯德酵母中的分泌性表達(dá)，SDS-PAGE分析及Western-blot檢測(cè)得到預(yù)期條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為95×103。免疫印跡分析表明，表達(dá)蛋白具有良好的抗原性和特異性。在建立的小鼠肝癌模型中用該重組蛋白作為疫苗進(jìn)行免疫，接種腫瘤細(xì)胞3天后開(kāi)始注射疫苗，每周1次，共4次，可見(jiàn)到一定的腫瘤抑制效應(yīng)。獲得高滴度的兔抗鼠的抗體，體外A431細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)顯示抗體有良好抑制效應(yīng)。結(jié)