EYFP-H148Q-I152L-HeLa細(xì)胞篩查模型的建立及應(yīng)用.pdf

1、研究背景:
　　氯、碘、溴等陰離子（鹵素）是維持人體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及發(fā)揮正常功能的重要成分。細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)水及各種離子的動(dòng)態(tài)平衡，依賴(lài)于細(xì)胞膜上各種通道蛋白及轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用。而陰離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)參與了細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)、遷移、增殖、凋亡、以及細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境pH的調(diào)節(jié)等各種生物活動(dòng)過(guò)程[1]。特別是在各種病理性損傷過(guò)程中，當(dāng)發(fā)生細(xì)胞腫脹等內(nèi)外液滲透壓的改變時(shí)，陰離子通過(guò)離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體等方式完成離子在細(xì)胞膜內(nèi)外的交換，起著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。本課題

2、組前期在staurosporine、缺血再灌注損傷及衣霉素分別通過(guò)線(xiàn)粒體、凋亡受體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑構(gòu)建的心肌細(xì)胞凋亡模型上，發(fā)現(xiàn)陰離子通道參與了細(xì)胞的凋亡過(guò)程，應(yīng)用特異性阻斷劑DCPIB和非特異性阻斷劑DIDS能有效抑制細(xì)胞凋亡性死亡，特別是在體心臟中能夠減少梗死面積、改善心臟功能、抑制心律失常的發(fā)生，達(dá)到保護(hù)受損心臟的作用[3-5]。然而，目前有關(guān)陰離子通道阻斷劑的使用僅保留在實(shí)驗(yàn)室水平、且種類(lèi)數(shù)量較少，藥品均為國(guó)外試劑公司所壟斷。

3、為此，我們的目的就是通過(guò)在已知的天然化合物庫(kù)中篩查出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的目的化合物。而如何尋找一種具有高效的、低成本的、天然化合物篩查技術(shù)顯得非常迫切與重要。
　　為了能夠?qū)ふ业揭环N高效、便捷、低成本的天然化合物篩選的方法，通過(guò)大量文獻(xiàn)檢索，研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）的熒光改變可以作為信號(hào)顯示細(xì)胞內(nèi)陰離子濃度的變化[6,7]。增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（enhancedyello

4、w fluorescent protein，EYFP），由于其pKa值高、對(duì)鹵化物更敏感[8]，并能被I-離子淬滅[9]，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用到消化道分泌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等的陰離子變化的研究。
　　本研究擬應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建搭載EYFP突變蛋白（EYFP-H148Q/I152L）基因的慢病毒載體，感染HeLa細(xì)胞，建立穩(wěn)定的細(xì)胞模型作為陰離子（鹵素）通道阻斷劑的篩查模型；并應(yīng)用構(gòu)建的EYFP-H148Q/I152L-HeLa

5、細(xì)胞篩查模型，對(duì)眾多的天然化合物進(jìn)行高通量篩查及評(píng)估。
　　研究目的:
　　1.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)突變熒光蛋白EYFP（EYFP-H148Q/I152L）的HeLa細(xì)胞作為陰離子（鹵素）通道阻斷劑篩選的細(xì)胞模型。
　　2.應(yīng)用EYFP-H148Q/I152L-HeLa細(xì)胞篩查模型，對(duì)天然化合物進(jìn)行高通量篩查，初步篩選出候選化合物，并對(duì)該模型進(jìn)行評(píng)估。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.基因重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)EYFP突變蛋白（

6、EYFP-H148Q/I152L）和puromycin抗性的慢病毒載體。
　　2.慢病毒載體和包裝質(zhì)?；旌衔镌?93T細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增、慢病毒顆粒感染HeLa細(xì)胞。
　　3.應(yīng)用puromycin抗性基因?qū)δ康募?xì)胞的篩選、純化，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EYFP突變蛋白的細(xì)胞系。
　　4.用Real Time-PCR和Western Blot對(duì)目的基因EYFP-H148Q/I152L檢測(cè)鑒定并擴(kuò)增目的細(xì)胞。
　　5.應(yīng)用FLIPR

7、 TETRA實(shí)時(shí)高通量熒光成像分析儀，進(jìn)行天然化合物的篩選。
　　6.實(shí)驗(yàn)分為4組：低滲I-溶液為陰性對(duì)照組，等滲Cl-為陽(yáng)性對(duì)照組，低滲I-溶液+DIDS組為標(biāo)準(zhǔn)參照組，及低滲I-溶液+化合物組為實(shí)驗(yàn)組。
　　7.評(píng)估高通量篩查模型公式：信噪比(Signal/Background Ratio，S/B)=信號(hào)平均值/本底平均值；Z’因子=1-(3×信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差+3×本底標(biāo)準(zhǔn)差)/｜信號(hào)平均值-本底平均值｜
　　8.天然化

8、合物的高通量篩查活性數(shù)據(jù)的處理公式：阻斷化合物反應(yīng)率=(待測(cè)化合物值-陽(yáng)性對(duì)照值)/(陰性對(duì)照值-陽(yáng)性對(duì)照值)×100％；阻斷活性=1-阻斷化合物反應(yīng)率。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.通過(guò)基因重組技術(shù)將表達(dá)EYFP-H148Q/I152L片段成功插入到慢病毒載體中，目的基因序列通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)得到證實(shí)。
　　2.慢病毒顆粒成功感染HeLa細(xì)胞，應(yīng)用puromycin抗性基因，完成了目的細(xì)胞的篩選、純化及單克隆擴(kuò)增。

9、　　3.Real Time-PCR和Western Blot檢測(cè)顯示：目的基因在HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了過(guò)表達(dá)（P＜0.05，n=8）。
　　4.熒光顯微鏡下可以觀察到EYFP-H148Q/I152L-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株能夠表達(dá)特有的黃色熒光，效率接近100%。
　　5.陰性對(duì)照組（低滲I-溶液），細(xì)胞發(fā)生明顯熒光淬滅；等滲I-溶液組，細(xì)胞發(fā)生輕微熒光淬滅；二組比較有顯著性差異（P＜0.01，n=16）。
　　6.陽(yáng)性對(duì)照

10、組（等滲Cl-溶液），細(xì)胞無(wú)熒光淬滅。陰性對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照相比，二組熒光強(qiáng)度比較有顯著性差異（P＜0.01，n=16）。
　　7.標(biāo)準(zhǔn)參照組（低滲 I-溶液+DIDS組）熒光淬滅減弱，與陰性對(duì)照組相比，二組間熒光強(qiáng)度比較有顯著性差異（P＜0.01，n=16）。
　　8.標(biāo)準(zhǔn)參照組DIDS濃度梯度實(shí)驗(yàn)，最后確定500μmol/L、50%的阻斷效率標(biāo)準(zhǔn)作為天然化合物的篩選標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)接種不同細(xì)胞密度、不同接種時(shí)間，獲得最佳實(shí)驗(yàn)條件

11、：2.5萬(wàn)/100μL細(xì)胞密度及鋪板24h后檢測(cè)熒光值最佳。
　　9.以等滲NaCl組、低滲NaI組，在高通量篩選儀上進(jìn)行 Z’因子，信噪比（Signal to Noise Ratio，SNR），來(lái)評(píng)估篩選模型；通過(guò)公式計(jì)算得到Z’因子為0.53，信噪比為5.14，提示該細(xì)胞模型穩(wěn)定性、特異性及敏感性符合高通量篩選標(biāo)準(zhǔn)。
　　10.在上述實(shí)驗(yàn)條件下，通過(guò)設(shè)立陰性、陽(yáng)性及標(biāo)準(zhǔn)參照組，與6988種天然化合物組熒光強(qiáng)度比較，第一次

12、篩選獲得425種陽(yáng)性結(jié)果；為了進(jìn)一步提高陽(yáng)性率，對(duì)上述425種化合物進(jìn)行第二重復(fù)篩選，獲得200種陽(yáng)性結(jié)果；對(duì)上述200種化合物進(jìn)行第三重復(fù)篩選，獲得7種陽(yáng)性化合物。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)EYFP-H148Q/I152L-HeLa細(xì)胞系，對(duì)I-低滲刺激發(fā)生明顯的熒光淬滅，是一種穩(wěn)定、高效、理想的陰離子（鹵素）通道阻斷劑篩查模型。
　　2.確立了標(biāo)準(zhǔn)參照藥DIDS最佳實(shí)驗(yàn)濃度及判斷標(biāo)準(zhǔn)，分別是500