基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的小泛蛋白樣修飾物的研究.pdf

1、小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的類(lèi)泛素修飾物，廣泛存在于真核生物中，是由多個(gè)成員組成的蛋白質(zhì)家族。在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種SUMO分子，分別為SUMO-1、SUMO-2及SUMO-3。SUMO修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)的可逆過(guò)程，在一系列酶的催化下，SUMO與靶蛋白Lys側(cè)鏈ε-NH2通過(guò)異肽鍵共價(jià)相連，從而介導(dǎo)不同的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。SUMO特異性蛋白酶（sentrin-spe

2、cific proteases，SENPs）在SUMO修飾過(guò)程中起了重要的調(diào)節(jié)作用。SENP是半胱氨酸蛋白酶超家族的成員之一，在真核生物體內(nèi)主要功能是切除SUMO前體的C端，及介導(dǎo)去SUMO化使SUMO分子重新進(jìn)入循環(huán)。至今已鑒定了7種哺乳動(dòng)物的SUMO特異性蛋白酶（sentrin-specific proteases，SENPs）家族成員，稱(chēng)為SENP-1，-2，-3，-5，-6，-7，和-8，SENP每一個(gè)成員有不同的細(xì)胞定位和底物

3、特異性。
　　 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonace energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)因其對(duì)距離的極度敏感性，被廣泛用于生物大分子結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、反應(yīng)機(jī)理以及定量分析等方面的研究。FRET以它穩(wěn)定、無(wú)生物體毒性、不需任何外源反應(yīng)底物及表達(dá)無(wú)種屬和組織特異性的優(yōu)點(diǎn)，成為檢測(cè)蛋白——受體、蛋白——蛋白之間相互作用和相對(duì)空間位置的“分子尺”。
　　 本研究的最終目的是檢測(cè)不同SENP對(duì)于3種S

4、UMO底物的底物特異性，測(cè)定酶活；構(gòu)建可在體外應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)檢測(cè)SENP酶活性的ECFP-SUMO-EYFP生物檢測(cè)系統(tǒng)。從而建立一種能用于臨床的的SENP蛋白酶活性檢測(cè)的體外FRET系統(tǒng)。
　　 在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)在供體增強(qiáng)型青色熒光蛋白（enhanced Cyan Fluorescent Poretin，ECFP）和受體增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（enhanced Yellow Fluorescent Por

5、etin，EYFP）之間以帶有SENP特異性識(shí)別酶切位點(diǎn)的SUMO肽段連接的融合蛋白ECFP-SUMO1，2，3-EYFP；原核表達(dá)哺乳動(dòng)物的SENP-1，-2，-3，-5 C端催化域及SENP-8全蛋白。融合蛋白ECFP-SUMO1，2，3-EYFP及SENP-1，-2，-3，-8可溶性表達(dá)在上清中。將以上蛋白進(jìn)行Ni柱親和層析。最終，融合蛋白ECFP-SUMO1，2，3-EYFP及SENP1C，2C，8可溶性表達(dá)在上清中并得到純化，