OsPT2基因過表達(dá)對低磷脅迫下菜用大豆結(jié)瘤固氮及氮代謝的影響.pdf

1、菜用大豆，又稱毛豆，指在鼓粒末期籽粒飽滿而尚未老熟時采青食用的大豆[Glycine max(L.) Merrill]，是大豆的專用型品種。豆科植物根瘤中的固氮過程是一個高耗能過程，有較高的磷素需求。然而由于磷素在土壤中易被固定、難以移動導(dǎo)致土壤中能被植物吸收利用的有效磷含量較低，土壤缺磷已成為共生固氮豆科植物生產(chǎn)的重要制約因素。因此，培育低磷環(huán)境下高效固氮的豆科品種對減少氮肥、磷肥的施用以及增強(qiáng)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性有重要意義。水稻磷轉(zhuǎn)運蛋白基

2、因OsPT2受低磷誘導(dǎo)顯著增強(qiáng)表達(dá)，主要起到轉(zhuǎn)運植物體內(nèi)磷素的作用。在前期研究中我們已獲得轉(zhuǎn)OsPT2基因磷高效利用的T3代菜用大豆種子，本研究以此為試驗材料，將分離純化的日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)接種于轉(zhuǎn)基因植株，采用蛭石盆栽的方法進(jìn)行低磷處理試驗，探究OsPT2基因的過表達(dá)能否提高轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)瘤固氮及氨同化能力，為培育氮磷協(xié)同高效的菜用大豆新品種提供理論依據(jù)和新種質(zhì)。主要研究結(jié)果如下:

3、>　　1、從大豆新鮮根瘤中分離純化得到3個分離物，分別命名為NAU1301、NAU1302、NAU1303，通過菌落形態(tài)觀察以及采用16S-23S rDNA基因間隔序列分析技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，確認(rèn)了分離的3個菌株均為Bradyrhizobium japonicum（日本慢生根瘤菌）。結(jié)瘤實驗進(jìn)一步確認(rèn)了分離物為根瘤菌，均能與菜用大豆（‘新遼鮮’品種）共生結(jié)瘤并具備固氮能力，對植株生長具有促進(jìn)作用。
　　2、采用砂培方法，設(shè)置5個磷水

4、平5、10、20、40、1000μM（正常磷水平），研究低磷脅迫對菜用大豆結(jié)瘤和固氮能力的影響。低磷條件下植株各器官有效磷和總磷含量顯著低于正常磷水平;低磷脅迫顯著降低了菜用大豆根瘤的生長發(fā)育和固氮能力，表現(xiàn)為株高、葉面積、地上部生物量、根瘤干重和根瘤體積顯著降低，植株總氮含量呈下降趨勢。低磷處理下根瘤干重降低的幅度比地上部干重、根系干重降低的幅度大，表明和植株生長相比，根瘤生長對缺磷更敏感。熒光定量PCR分析顯示，和正常磷水平相比，在

5、根瘤發(fā)育過程中(0-11 d)，結(jié)瘤關(guān)鍵基因GmENOD40-1、GmENOD40-2、GmNIN1a、GmNIN1b、GmRIC1和GmRIC2的表達(dá)量在低磷處理的不同時間點顯著降低;早期結(jié)瘤信號識別的受體激酶基因GmNFR1α/β、GmNFR5α/β、GmSymRKα/β的表達(dá)量在低磷和正常磷處理之間并無顯著差異。表明低磷脅迫通過抑制若干結(jié)瘤關(guān)鍵基因的表達(dá)而抑制根瘤后期的發(fā)育、成熟，但對早期根瘤菌結(jié)瘤因子信號的識別過程沒有影響。

6、r>　　3、以三個T3代純合株系轉(zhuǎn)OsPT2基因菜用大豆（編號12PT2-1-1-1、12PT2-2-1-3和12PT2-4-3-1）為試驗材料，采用蛭石盆栽的方法進(jìn)行低磷實驗，探究低磷條件下OsPT2過表達(dá)對菜用大豆結(jié)瘤固氮和氨同化能力的影響。結(jié)果顯示，低磷條件下T3代轉(zhuǎn)基因植株的生長表現(xiàn)、種子重量和根瘤發(fā)育均顯著優(yōu)于野生型。T3代轉(zhuǎn)基因植株的磷含量、總氮含量及酰脲濃度顯著高于野生型植株，說明過表達(dá)OsPT2基因促進(jìn)了低磷條件下轉(zhuǎn)基因

7、植株體內(nèi)磷、氮、酰脲的積累。熒光定量PCR分析顯示，低磷處理24 d和32d，早期結(jié)瘤素基因（GmENOD40-1、GmENOD40-2），豆血紅蛋白基因（GmLba）和谷氨酰胺合成酶基因（GmGS1β1、GmGS1β2）在T3代轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)量顯著高于野生型;GmGS1β1和GmGS1β2基因表達(dá)量的增加和轉(zhuǎn)基因植株中GS酶活性的增加一致。GmLba基因表達(dá)量的增加和轉(zhuǎn)基因植株中豆血紅蛋白含量的增加相一致。以上結(jié)果表明，低磷脅迫下O