低磷脅迫大豆RT-qPCR內參基因的篩選及谷胱丙肽合成代謝酶的表達.pdf

1、磷是植物的必要元素之一，缺磷使植物的生長活動受到影響。谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是普遍存在于植物體內的抗氧化劑，在植物抵抗低磷脅迫中起重要作用。GSH是植物細胞內主要的還原性物質，其通過Asada-Halliwell的方式，有效清除植物生理生化活動產生的過多的活性氧，保護植物體內生物大分子物質免受活性氧的傷害。GSH是在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)和谷胱甘肽合成酶(hGSHS)的催化作用完成的，γ-ECS和hG

2、SHS分別由γ-ECS和hGSHS基因編碼。γ-ECS和hGSHS基因表達量、γ-ECS和hGSHS酶活水平、GSH的含量之間相互作用來有效應對逆境脅迫。植物絡合素(Phytochelatins，PC)是以GSH為反應底物合成的，PC可由外界重金屬離子誘導產生，PC通過Cys上的硫基結構與重金屬離子螯合以減少重金屬離子對植物的毒害作用。大豆中的GSH類物質為谷胱丙肽(Homoglutataione，hGSH)，hGSH幾乎具有GSH的所

3、有功能;同樣大豆中的同源植物絡合素(Homophytochelatin，hPC)亦能實現(xiàn)PC的所有功能。篩選穩(wěn)定的內參基因是實時熒光定量PCR(Real-time quantitativePCR，RT-qPCR)的先決條件。
　　本實驗以大豆耐低磷品種桂夏2號(GX2)和低磷敏感品種桂香1號(GX1)為材料，對大豆進行1/5 Hoagland全營養(yǎng)液和低磷(0.2μmol/L KH2PO4)處理，收集2d、4d、8d、12 d和1

4、6 d根尖和葉片為材料，采用GeNorm分析法、NormFinder分析法、BestKeeper分析法、△Ct對比分析法和RefFinder分析法分析低磷脅迫下15個內參基因(18sRNA,ACT,ATP,CYP,Ef1-α,Ef1-β,G6PDH,PE,PP2A,PSC,TIF,TUB,UNK1,UNK2，Letin)的穩(wěn)定性，并選用最穩(wěn)定的內參基因計算不同磷脅迫時期γ-ECS和hGSHS的表達水平，同時運用分光光度法研究了不同磷脅迫

5、時期γ-ECS和hGSHS的酶活力水平，使用液質聯(lián)用法檢測了低磷脅迫下hGSH和hPCs的含量變化。
　　結果:在所有樣品組中最穩(wěn)定性最好是PSC、18sRNA和TUB，穩(wěn)定性排在最后的是PE和CYP;低磷實驗組，穩(wěn)定性最好的是PP2A;空白組，ACT是最穩(wěn)定最好的內參基因;葉片中顯示TIF穩(wěn)定性最好;根部顯示穩(wěn)定性最佳的是PE。根據(jù)對15個內參基因配對差異分析，本實驗宜同時使用3個內參基因(PSC,18sRNA和TUB)計算γ-

6、ECS和hGSHS的相對表達量(Fold change，F(xiàn)C)。低磷脅迫下，GX1根部和葉部γ-ECS和hGSHS的相對表達量都隨著脅迫時間延長而呈現(xiàn)減少趨勢;GX2根部γ-ECS和hGSHS的相對表達量都隨著脅迫時間延長而增加;葉片中，γ-ECS的相對表達量亦呈現(xiàn)增加趨勢，而hGSHS的相對表達量則減少;GX2的根部和葉部γ-ECS和hGSHS的酶活力都隨脅迫時間的延長而上升，且根部上升的幅度要大于葉部，hGSH含量在GX2的根部和葉