在電脈沖刺激調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞Akt機(jī)制中Axin1的作用研究.pdf

1、目的：
　　骨骼肌是攝取餐后葡萄糖的主要器官，胰島素刺激骨骼肌細(xì)胞攝取葡萄糖是維持血糖平衡的關(guān)鍵，攝取葡萄糖通過(guò)GLUT4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜完成。骨骼肌胰島素抵抗是指胰島素刺激骨骼肌攝取葡萄糖的能力減弱，導(dǎo)致持續(xù)的餐后高血糖。肌肉收縮能促進(jìn)骨骼肌攝取葡萄糖，改善胰島素敏感性。本課題組致力研究肌肉收縮促進(jìn)骨骼肌葡萄糖攝取的分子機(jī)制，我們用過(guò)表達(dá) GLUT4HA的小鼠C2C12-GLUT4HA細(xì)胞株，采取電脈沖刺激的方法模擬運(yùn)動(dòng)造成的骨骼肌

2、收縮，發(fā)現(xiàn)電刺激可以通過(guò)激活A(yù)MPK增加Rac1的活性，從而磷酸化Akt。Axin1是多功能的支架蛋白，含有與多種分子結(jié)合的位點(diǎn)或者結(jié)構(gòu)域，參與了多種生理病理過(guò)程，Axin1可能參與到運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)的AMPK信號(hào)通路。本研究用siRNA干擾技術(shù)在體外培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞中沉默 Axin1蛋白，探究 Axin1在電刺激作用下調(diào)節(jié)Akt的分子機(jī)制。
　　內(nèi)容：
　　第一部分：以3T3-L1脂肪細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)大鼠L6成肌細(xì)胞、小鼠C

3、2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞和小鼠骨骼肌中Axin1蛋白的表達(dá)，檢測(cè)電刺激對(duì)C2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞中Axin1蛋白表達(dá)的影響。
　　第二部分：采用siRNA下調(diào)C2C12-GLUTHA細(xì)胞Axin1蛋白表達(dá)，檢測(cè)基因沉默效果，研究siAxin1對(duì)電刺激條件下AMPK、PAK、Akt、AS160、PKC的磷酸化水平和Rac1活性的影響，細(xì)胞水平上研究AMPK和Axin1的相互關(guān)系。
　　第三部分：喂養(yǎng)C57BL

4、/6小鼠到12周齡，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、胰島素刺激組和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組，檢測(cè)各組骨骼肌中Axin1的表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究AMPK和Axin1的相互關(guān)系。
　　方法：
　　將小鼠C2C12-GLUTHA骨骼肌細(xì)胞分化成肌管細(xì)胞，用胰島素或電脈沖刺激的方法刺激肌管細(xì)胞，免疫印跡法檢測(cè)Axin1蛋白的表達(dá)。采用siRNA技術(shù)基因沉默Axin1，Western blot檢測(cè)其對(duì)電刺激介導(dǎo)的C2C12-GLUT4HA細(xì)胞相關(guān)信號(hào)分子磷酸化

5、水平變化的影響。12周齡的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組①無(wú)任何處理的空白對(duì)照組②腹腔注射胰島素組③跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組，免疫印記法測(cè)定各組Axin1的表達(dá)量，免疫共沉淀的方法測(cè)定運(yùn)動(dòng)下Axin1和AMPK相互作用。結(jié)果：
　　第一部分結(jié)果顯示：Axin-1在L6成肌細(xì)胞、C2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞和小鼠骨骼肌中均表達(dá)，并且電刺激C2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞顯著升高Axin1的蛋白水平。
　　第二部分結(jié)果顯示：當(dāng)用siR

6、NA技術(shù)將C2C12-GLUTHA肌管細(xì)胞中Axin1基因沉默后，顯著抑制電刺激C2C12-GLUT4HA肌管細(xì)胞后升高的AMPK、PAK、Akt和AS160信號(hào)分子的磷酸化水平、降低Rac1的活性，但對(duì)PKC的磷酸化水平無(wú)影響，Axin1和AMPK的免疫共沉淀作用在電刺激的作用下明顯加強(qiáng)。
　　第三部分結(jié)果顯示：運(yùn)動(dòng)增加C57BL/6小鼠骨骼肌中Axin1的蛋白表達(dá)，并且增強(qiáng)Axin1和AMPK的免疫共沉淀作用。
　　結(jié)論