鯽魚可溶性leptin受體的鑒定及其與leptin的互作分析.pdf

1、瘦素(leptin)是肥胖基因(ob)的編碼產(chǎn)物，為16 kDa的親水性多肽，在哺乳動(dòng)物中主要由脂肪組織合成，而在魚類中主要在肝臟產(chǎn)生。成熟的leptin進(jìn)入血液，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中發(fā)揮作用，參與機(jī)體的多種生物學(xué)功能，包括攝食調(diào)節(jié)、能量平衡、生長(zhǎng)、生殖、免疫和骨代謝等。研究表明，leptin必須通過與leptin受體(leptin receptor，LepR)結(jié)合，才能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
　　LepR是一種跨膜受體，屬于Ⅰ類細(xì)

2、胞因子受體家族，廣泛分布于動(dòng)物機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織中，通過mRNA的可變剪接和/或蛋白酶水解作用產(chǎn)生了多種LepR亞型，魚類中最早由Wong等人在海洋青鯔(Oryzias melastigma)中克隆了長(zhǎng)型LepR的cDNA序列。截至目前，在魚類中被發(fā)現(xiàn)的LepR大多只有一種，只在大西洋鮭魚、鯽魚、虹鱒魚和羅非魚中克隆出了受體的不同亞型。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)從鯽魚中克隆了三種LepR亞型的eDNA序列，分別是長(zhǎng)型受體cclpr-L、幾乎

3、不含胞內(nèi)區(qū)的“無(wú)尾”短型受體cclpr-S1、不含跨膜區(qū)的短型受體cclpr-S2（推測(cè)編碼可溶性受體）。目前關(guān)于魚類可溶性LepR的研究還很少。
　　本研究從蛋白水平進(jìn)一步對(duì)鯽魚cclpr-S2進(jìn)行檢測(cè)與分析，比較cclpr-S2與leptin-a和leptin-b的結(jié)合能力差異;并構(gòu)建cclpr-S1、cclpr-L的真核熒光蛋白載體，為以后研究cclpr-S1的內(nèi)化以及cclpr-L與cclpr-S1的異二聚體化等問題打下基

4、礎(chǔ)。
　　1.通過RT-PCR和RACE技術(shù)，擴(kuò)增獲得leptin-b的完整的編碼區(qū)和3'UTR，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明鯽魚leptin-b與建鯉同源性最高，兩者再與草魚匯成一支，最終與斑馬魚匯成一支。
　　2.為了在蛋白水平上檢測(cè)并分析血清中cclpr-S2與leptin-a、leptin-b的結(jié)合差異，以進(jìn)一步了解leptin-a、leptin-b的不同功能。我們首先構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32-leptin-b，在25℃、0

5、.1 mM IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)pET32-leptin-a和pET32-leptin-b，并用鎳柱進(jìn)行純化;提取鯽魚血清進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與Trx-leptin-b相比，鯽魚血清中的cclpr-S2更容易被Trx-leptin-a所吸附，說明leptin-a與cclpr-S2的結(jié)合能力比leptin-b強(qiáng)，推測(cè)leptin-a可能是LepR的主要配體。
　　3.構(gòu)建真核熒光蛋白載體 pcDNA3.1-cclpr-