丹酚酸B通過SIRT1下調(diào)CRP和ChREBP表達減輕大鼠慢性酒精性肝損傷.pdf

1、慢性酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD）是長期大量飲酒所致的慢性肝臟疾病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴重影響人們的健康生活水平。根據(jù)肝臟病理學(xué)改變的不同階段可將 ALD分為：酒精性脂肪肝（Alcoholic fatty liver，AFL）、酒精性肝炎（Alcoholic hepatitis，AH）、酒精性肝纖維化（Alcoholic hepatic fibrosis，AHF）及酒精性肝硬化（Alcoho

2、lic cirrhosis，AC）。目前研究顯示，慢性酒精性肝病的發(fā)病機制十分復(fù)雜且治療手段十分有限，因此，研究和掌握 ALD發(fā)病機制并探索有效干預(yù)措施具有重要臨床意義。
　　丹酚酸B（Salvianolic acid B，SalB）是丹參根部提取的主要水溶性成分之一，屬于多酚類化合物。研究表明丹酚酸B具有抗氧化、抗炎、抗纖維化及抗癌等多種藥理特性，已廣泛應(yīng)用于多種疾病的防治，如肝、肺、腎等疾病。丹酚酸B對肝纖維化動物模型具有顯著

3、的保護作用。此外，因其抗炎、抗氧化特性，對心臟及神經(jīng)方面的疾病也具有明顯保護作用。然而丹酚酸B對慢性酒精性肝損傷的保護作用和潛在的分子機制尚未見報道。
　　我們前期研究已證實天然化合物丹酚酸B可影響沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶I（Silent Information Regulator2-related Enzymes1，Sirtuin1，SIRT1)的蛋白表達。SIRT1是廣泛表達于哺乳動物體內(nèi)的III型組蛋白去乙?；福诙喾N細胞

4、生物學(xué)功能中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，如基因轉(zhuǎn)錄、衰老、能量代謝、氧化還原平衡、炎癥及DNA損傷修復(fù)、凋亡。肝細胞核因子1α（Hepatic nuclear factor-1α，HNF-1α）是一種具有同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，可與復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)相互作用進而調(diào)控肝臟、腎及胰島β細胞的相關(guān)基因表達。新近研究表明HNF-1α可與C型反應(yīng)性蛋白（C-reactive protein，CRP）的啟動子區(qū)結(jié)合進而調(diào)控其表達。CRP蛋白主要在肝臟中表達，

5、在多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展進程中產(chǎn)生關(guān)鍵作用。有研究顯示，在營養(yǎng)缺失的情況下，SIRT1通過脫去HNF-1α結(jié)合位點近端組蛋白H4賴氨酸16位點的乙?；M而抑制HNF-1α介導(dǎo)的CRP啟動子轉(zhuǎn)錄活化。碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（Carbohydrate response element-binding protein，ChREBP）主要參與糖酵解和脂生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活化，在 ALD的疾病進程中發(fā)揮重要的作用。肝臟SIRT1特異性敲除的小

6、鼠 ChREBP蛋白表達明顯上調(diào)，伴隨嚴重的肝脂肪變。此外，本實驗室新近研究已證實多酚類雙萜化合物鼠尾草酸（Carnosic acid，CA）可通過激活 SIRT1/ChREBP信號通路減輕大鼠慢性酒精性脂肪肝病。綜上所述，我們提出以下假說：1）SIRT1是慢性酒精性肝損傷的重要調(diào)控分子，長期慢性酒精攝入所致SIRT1的表達變化可直接或間接影響炎癥相關(guān)蛋白CRP及脂代謝相關(guān)蛋白ChREBP的表達，進而參與調(diào)控ALD的疾病進程；2）丹酚酸

7、B可通過靶向SIRT1發(fā)揮其抗慢性酒精性肝病的保護作用。
　　AMP依賴的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成的異源三聚體）是機體能量代謝的主要調(diào)控子，可增加NAD+的水平。SIRT1是NAD+依賴的蛋白去乙?；?，營養(yǎng)攝入受限或應(yīng)激反應(yīng)時NAD+水平升高可激活SIRT1進而參與調(diào)控能量代謝及應(yīng)激反應(yīng)。研究表明AMPK和SIRT1之間存在相互調(diào)控作用，在能量代謝及

8、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控中相輔相承。因此，我們推測AMPK可能參與介導(dǎo)丹酚酸B對SIRT1蛋白表達的調(diào)控。
　　本課題將從以下三部分展開論述：
　　1)丹酚酸B對長期攝入酒精所致大鼠肝損傷的保護作用；
　　2) SalB通過SIRT1抑制CRP和ChREBP表達減輕大鼠慢性酒精性肝損傷；
　　3)SalB通過AMPKα1激活SIRT1緩解大鼠慢性酒精性肝損傷。
　　我們的研究結(jié)果顯示，丹酚酸 B對大鼠慢性酒精性肝損傷

9、具有顯著的保護作用，而肝臟SIRT1表達是其發(fā)揮保護作用的關(guān)鍵。丹酚酸B可以通過激活SIRT1進而抑制炎癥相關(guān)蛋白CRP及脂代謝相關(guān)蛋白ChREBP的表達減輕大鼠慢性酒精性肝損傷。本研究有助于為ALD的防治提供新的靶點，同時也為丹酚酸B的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供新的方向。
　　第一部分丹酚酸B對長期酒精攝入所致肝損傷的保護作用
　　目的：
　　探討SalB對慢性ALD的保護作用，明確SalB對長期酒精攝入的大鼠肝臟病理學(xué)和肝

10、臟功能、血清及肝組織中脂質(zhì)堆積、炎癥因子以及對酒精誘導(dǎo)的HepG2細胞存活率的影響。
　　方法：
　　1.丹酚酸B對大鼠慢性酒精性肝損傷的保護作用研究。
　　將50只健康成年的雄性SD大鼠（180-220g）隨機分為以下5組：空白對照組；空白對照+SalB給藥組（30 mg/kg/d）；模型組；模型+低劑量SalB給藥組（15 mg/kg/d）；模型+高劑量SalB給藥組（30 mg/kg/d）。給藥方法為灌胃，酒精造

11、模參照Lieber-Decarli方案，酒精濃度前6周5%，最后兩周8%。8周后腹主動脈采集血液，分離大鼠肝臟組織標本。檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）以及肝組織中總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglycerides，TG）、白介素6（Interleukin-6，IL-6）、腫

12、瘤壞死因子α（Tumor necrosisα，TNF-α）的活性。
　　2、丹酚酸B對酒精誘導(dǎo)HepG2細胞損傷的保護作用研究。
　　HepG2細胞隨機分成五組：空白對照組；EtoH組（EtoH濃度為100 mM）；低、中、高劑量丹酚酸B處理組（2μM、4μM、8μM）。在細胞中加入100 mM EtoH孵育48h造模，造模前、造模同時及造模后加入藥物進行處理，MTT實驗測定細胞存活率。
　　結(jié)果：
　　1.與空

13、白對照組相比，模型組肝組織病理學(xué)檢測結(jié)果顯示肝臟細胞腫脹變形且存在大泡型和小泡型相間的肝脂肪病變，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝臟炎性細胞浸潤明顯增加；血清 ALT、AST及肝組織 TG、TC、IL-6、TNF-α的水平顯著增加，表明肝組織存在中度或重度脂肪變，出現(xiàn)嚴重肝損傷和炎癥反應(yīng)。與模型組相比，丹酚酸 B預(yù)處理組肝組織病理結(jié)果顯示肝臟脂質(zhì)堆積及炎癥浸潤明顯得到改善；血清ALT、AST水平下降；肝組織TG、TC以及IL-1β、TNF-α水平顯著

14、降低，提示丹酚酸B可明顯減輕長期酒精攝入引起的大鼠肝組織損傷和炎癥反應(yīng)。
　　2.在酒精導(dǎo)致的肝損傷體外模型中，分別在造模前、造模同時及造模后加入丹酚酸B，與模型組相比，三種方式的丹酚酸B處理組HepG2細胞存活率明顯提高，在中、高劑量組尤為明顯，且呈劑量依賴性。表明丹酚酸B對HepG2細胞酒精損傷具有保護作用。
　　結(jié)論：
　　丹酚酸B對長期酒精攝入引起的肝損傷具有顯著的保護作用。
　　第二部分 SalB通過S

15、IRT1抑制CRP和ChREBP表達減輕大鼠慢性酒精性肝損傷
　　目的：
　　探討SIRT1/CRP及SIRT1/ChREBP通路在慢性酒精性肝病中的作用，進一步闡明丹酚酸B對慢性酒精性肝病的保護作用機制。
　　方法：
　　1.丹酚酸B對大鼠慢性酒精性肝損傷SIRT1、CRP、HNF-1α、ChREBP蛋白和基因表達的影響。
　　按第一部分方法將正常SD大鼠分組，酒精造模8周結(jié)束后分離肝組織標本冷凍備用。采

16、用Western Blot法檢測肝組織中SIRT1、CRP、HNF-1α、ChREBP及β-actin的蛋白水平；采用qRT-PCR法檢測肝組織CRP及ChREBP的mRNA水平；
　　2.探討SIRT1/CRP和SIRT1/ChREBP通路在酒精誘導(dǎo)的HepG2細胞損傷中作用及丹酚酸B的保護作用機制。
　　實驗1.（1）HepG2細胞隨機分為4組：陰性對照組；陰性對照+SalB（8μM）組；轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA組；轉(zhuǎn)

17、染SIRT1 siRNA+SalB（8μM）組。轉(zhuǎn)染后，SalB給藥作用3h后提取細胞總蛋白。Western Blot法檢測細胞內(nèi)SIRT1及CRP的蛋白表達情況。（2）HepG2細胞隨機分為五組：陰性對照組；陰性對照+EtoH組；陰性對照+EtoH+SalB（8μM）組；EtoH+轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA組；EtoH+轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA+SalB（8μM）組。轉(zhuǎn)染后，丹酚酸B給藥作用3h后，用EtoH（100 mM）誘導(dǎo)48

18、 h后提取細胞蛋白。Western Blot法檢測細胞內(nèi)SIRT1及ChREBP的蛋白表達情況。
　　實驗2. HepG2細胞隨機分為5組：空白對照組；SalB（8μM）給藥組；EtoH組；EtoH+SalB（8μM）給藥組；EtoH+Ex527（10μM）預(yù)處理組。Ex527是SIRT1特異性的抑制劑。丹酚酸B或Ex527與細胞共同孵育3h或6h后，用濃度為100 mM的EtoH誘導(dǎo)48h造模。Western Blot法檢測細胞

19、內(nèi)SIRT1、CRP的蛋白表達水平。尼羅紅染色法檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的情況。
　　實驗3. HepG2細胞隨機分為4組：陰性對照組；陰性對照+SalB（8μM）組；轉(zhuǎn)染HNF-1αsiRNA組；轉(zhuǎn)染HNF-1αsiRNA+SalB（8μM）組。轉(zhuǎn)染后，SalB給藥作用6h后,用濃度為100 mM的EtoH誘導(dǎo)48h后提取細胞蛋白及RNA。Western Blot法檢測細胞內(nèi)SIRT1、CRP及HNF-1α的蛋白表達情況。qRT-PC

20、R法檢測HepG2細胞HNF-1α的mRNA水平。
　　實驗4. HepG2細胞隨機分為4組：陰性對照組；陰性對照+RES（10μM）組；轉(zhuǎn)染HNF-1αsiRNA組；轉(zhuǎn)染HNF-1αsiRNA+RES（10μM）組。轉(zhuǎn)染后，RES給藥作用6h后,用終濃度為100 mM的EtoH誘導(dǎo)48h后提取細胞蛋白。Western Blot法檢測細胞內(nèi)SIRT1、CRP及HNF-1α的蛋白表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.體內(nèi)實驗結(jié)

21、果顯示：與空白對照組相比，模型組大鼠肝組織SIRT1及HNF-1α表達降低，肝組織CRP及ChREBP蛋白表達及mRNA水平顯著升高。與模型組相比，丹酚酸B預(yù)處理后顯著上調(diào)SIRT1及HNF-1α的蛋白表達水平，同時CRP及ChREBP的蛋白及mRNA水平明顯降低。
　　2.體外實驗結(jié)果：
　　實驗1.（1）與陰性對照組相比，SalB可顯著上調(diào)SIRT1蛋白表達，抑制CRP蛋白表達；SIRT1基因被干擾后，CRP蛋白表達上調(diào)

22、，同時SalB對CRP蛋白表達的抑制作用減弱甚至消失，即SalB對CRP蛋白的調(diào)控可能是通過激活SIRT1實現(xiàn)的。（2）與陰性對照組相比，陰性對照+EtoH組SIRT1蛋白表達降低而ChREBP蛋白表達顯著升高；與陰性對照+EtoH組相比，SalB預(yù)處理可顯著上調(diào)SIRT1蛋白表達，同時抑制 ChREBP蛋白表達；SIRT1基因被干擾后，ChREBP蛋白表達上調(diào)，同時SalB對ChREBP的抑制作用減弱甚至消失，表明SalB對ChREB

23、P蛋白的調(diào)控作用與SIRT1有關(guān)。
　　實驗2.與EtoH組相比，SalB預(yù)處理可顯著上調(diào)SIRT1蛋白表達，同時抑制CRP蛋白表達，而采用Ex527特異性的阻斷SIRT1的蛋白表達后，CRP蛋白表達顯著上調(diào)，進一步證實SIRT1介導(dǎo)SalB對CRP蛋白表達的調(diào)控。
　　實驗3.與陰性對照組相比，SalB可顯著上調(diào)SIRT1及HNF-1α的蛋白表達，抑制CRP的蛋白表達；HNF-1α基因被干擾后，SalB對SIRT1的激活作

24、用不變，而對CRP的抑制作用明顯減弱甚至消失，即HNF-1α參與SalB對SIRT1調(diào)節(jié)的CRP表達抑制。
　　實驗4.與陰性對照組相比，SIRT1激活劑白藜蘆醇（Resveratrol，RES）上調(diào)HNF-1α蛋白表達，同時抑制CRP蛋白表達；HNF-1α基因被干擾后，RES對SIRT1的激活作用不變，而對 CRP蛋白表達的抑制作用明顯減弱甚至消失，即 SalB對SIRT1/CRP通路的調(diào)控主要是通過HNF-1α調(diào)節(jié)實現(xiàn)的。

25、r>　　結(jié)論：
　　1. SIRT1/CRP和SIRT1/ChREBP信號通路在大鼠慢性酒精性肝病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用；
　　2.在酒精誘導(dǎo)的ALD中，SalB通過上調(diào)SIRT1抑制CRP和ChREBP的蛋白表達，從而發(fā)揮抗慢性酒精性肝病的保護作用。
　　第三部分 SalB通過AMPKα1激活SIRT1緩解大鼠慢性酒精性肝損傷
　　目的：
　　探討SalB通過調(diào)控AMPKα1激活SIRT1發(fā)揮肝保護作用的分

26、子機制。
　　方法：
　　1. SalB對AMPKα1蛋白磷酸化水平的影響。
　　正常SD大鼠酒精造模8周結(jié)束后分離肝組織標本冷凍備用。采用western-blot法檢測肝組織中AMPKα1、p-AMPKα1及β-actin的蛋白水平；
　　2.探究SalB激活SIRT1的相關(guān)分子機制。
　　采用RNA干擾等實驗，在體外細胞模型檢測丹酚酸 B對 AMPKα1及pAMPKα1蛋白表達水平的影響，進一步探討丹酚

27、酸B激活SIRT1的分子機制。1） HepG2細胞隨機分為四組：空白組；空白+SalB（8μM）組；EtoH組；EtoH+SalB（8μM）組。丹酚酸B給藥作用3h后，用EtoH（100 mM）誘導(dǎo)48 h后提取細胞蛋白。Western Blot法檢測細胞內(nèi)AMPKα1、p-AMPKα1及β-actin的蛋白表達情況。2）HepG2細胞隨機分為四組：陰性對照組；陰性對照+SalB（8μM）組；轉(zhuǎn)染AMPKα1 siRNA組；轉(zhuǎn)染AMPK

28、α1 siRNA+SalB（8μM）組。轉(zhuǎn)染后，丹酚酸B給藥作用3h后提取細胞蛋白。Western Blot法檢測細胞內(nèi)SIRT1、AMPKα1、p-AMPKα1及β-actin的蛋白表達情況。3）HepG2細胞隨機分為五組：陰性對照組；陰性對照+EtoH組；陰性對照+EtoH+SalB（8μM）組；EtoH+轉(zhuǎn)染AMPKα1 siRNA組；EtoH+轉(zhuǎn)染AMPKα1 siRNA+SalB（8μM）組。轉(zhuǎn)染后，丹酚酸B給藥作用3h后，用

29、EtoH（100 mM）誘導(dǎo)48 h造模，MTT實驗測定細胞存活率。
　　結(jié)果：
　　1.體內(nèi)實驗結(jié)果顯示：慢性酒精性肝病大鼠肝組織中p-AMPKα1的蛋白表達水平明顯下調(diào)，而給予丹酚酸B預(yù)處理后可顯著逆轉(zhuǎn)p-AMPKα1蛋白表達下降，且呈一定的劑量依賴性。
　　2.體外實驗結(jié)果顯示：1）在HepG2細胞中，與空白組相比，丹酚酸B給藥組可上調(diào) p-AMPKα1的蛋白表達，而與模型組相比，丹酚酸 B預(yù)處理亦可上調(diào)p-AM

30、PKα1的蛋白表達；2）HepG2細胞轉(zhuǎn)染AMPKα1 siRNA后，AMPKα1基因的表達被抑制。與陰性對照組相比，丹酚酸B預(yù)處理組可顯著上調(diào)p-AMPKα1、SIRT1的蛋白表達，干擾AMPKα1后，丹酚酸B對p-AMPKα1、SIRT1的上調(diào)作用明顯減弱甚至消失；3）在酒精誘導(dǎo)的肝損傷體外模型中，與陰性對照組相比，酒精誘導(dǎo)的HepG2細胞存活率明顯降低，給予丹酚酸B預(yù)處理后，HepG2細胞存活率明顯提高；當同時給予酒精誘導(dǎo)時，與空