無創(chuàng)性軸向載荷建立兔腰椎間盤退變動物模型及其退變機制探索.pdf

1、椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IDD）是一個多因素導致的病理過程，其典型表現為髓核組織脫水、蛋白多糖缺失、細胞數量減少、纖維環(huán)排列紊亂及破裂等，是椎間盤突出癥的主要病理基礎，也是許多脊柱退行性疾病的使動原因。目前對椎間盤退變的發(fā)病機制以及病理生理方面的認識仍較為缺乏。椎間盤退變動物模型在闡明其發(fā)病機制以及評估新的治療方法方面發(fā)揮了重要作用，然而，當前還沒有理想的椎間盤退變動物模型用以模擬人

2、類椎間盤退變。人類脊柱解剖結構和肌肉系統(tǒng)在經過長期進化后與四足動物形成了巨大差別，作用于脊柱的應力類型和強度均與四足動物不同。人類所特有的直立體位和直立體位下的應力刺激也被認為與脊柱相關疾病的高發(fā)生率相關。
　　本研究以兔為研究對象，通過無創(chuàng)性脊柱軸向加壓的方法建立一種新型椎間盤退變體內動物模型。這種造模方式能夠更好的模擬人類椎間盤早期退變的自然進程，從而為椎間盤退變研究提供更加合理的動物模型。在此基礎上，通過對該模型退變進程的長

3、時間實驗觀察，從分子生物學和病理學方面深入探索椎間盤退變的相關機理。
　　第一部分無創(chuàng)性軸向積累性載荷建立兔腰椎間盤退變動物模型
　　目的：通過直立體位下無創(chuàng)性軸向加載的方式，建立一種新型兔腰椎間盤退變的動物模型，使之更好的模擬人類腰椎間盤退變。
　　方法：24只新西蘭大白兔隨機分為實驗組及對照組，每組12只動物。將實驗組動物置于特制的透明塑料桶內使之保持直立體位，并通過特制的頸圈使之負重600g，每日實驗干預時間為6

4、h。對照組動物不接受任何處理而常規(guī)飼養(yǎng)。通過特制裝置測量實驗組動物在筒內直立體位時與筒壁間的摩擦力。在實驗開始前及實驗開始后4周、8周12周對全部動物行X線及核磁共振（MRI）檢查，觀察實驗組動物在筒內時腰椎的骨性結構，比較2組動物腰椎間隙高度改變以及髓核含水量變化。實驗干預12周后實驗組動物不再接受載荷刺激，同對照組一樣常規(guī)飼養(yǎng)2周，以恢復因壓力導致的椎間盤水合改變，14周時行末次MRI檢查。而后實驗組及對照組全部動物處死，取L4-5

5、節(jié)段椎間盤髓核標本，通過realtime-PCR檢測細胞外基質基因I型膠原、II型膠原及蛋白多糖表達水平；取L6-7節(jié)段椎間盤行正中矢狀面病理切片，通過HE及天狼星紅染色觀察各組動物椎間盤內組織病理學改變。
　　結果：2只實驗組動物分別在實驗進行至3周及7周時死亡，其相應的實驗數據從結果中剔除。實驗組剩余的10只動物對實驗處理耐受良好。實驗組動物與筒壁間相對摩擦力測量顯示，開始時摩擦力占體重的19％，隨時間逐漸下降，到20min時

6、，摩擦力降至11.1%，在此后的40min測量時間內均在該水平波動。腰椎X線片顯示實驗組動物在直立體位負重條件下腰椎形成明顯后凸，較側臥體位下腰椎間隙明顯變窄。在L2-3節(jié)段，直立體位下DHI為側臥位時的74.4%；在L4-5節(jié)段為60.7%；在L6-7節(jié)段為46.5%。各節(jié)段間DHI改變幅度也存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）。椎間盤高度指數（disc height index,DHI）測量顯示2組動物腰椎各節(jié)段DHI隨時間逐漸變小，但2

7、組間在任何時間點均無顯著差異。MRI檢查顯示，實驗組與對照組髓核相對灰度值均隨時間進行性下降；在 L2-3節(jié)段，實驗組與對照組髓核灰度值在任何時間點均無統(tǒng)計學差異；在L4-5節(jié)段，2組間髓核灰度值在12周時具有統(tǒng)計學差異，在2周的恢復期后，2組間仍然具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；在L6-7節(jié)段，2組間髓核灰度值在8周時即開始有顯著性差異，并持續(xù)至實驗結束（P<0.05）。髓核組織細胞外基質相關基因表達檢測顯示，實驗組I型膠原mRNA表

8、達明顯高于對照組（3.57倍，P<0.05）;而II型膠原及蛋白多糖表達明顯低于對照組（分別為0.35倍和0.43倍，P<0.05）。
　　病理學檢查發(fā)現對照組與實驗組椎間盤組織結構存在顯著差異：對照組 HE染色顯示髓核組織與纖維環(huán)間邊界清晰，髓核內富含均勻分布的髓核細胞；天狼星紅染色顯示纖維環(huán)結構完整無損壞，纖維環(huán)與髓核間界限清晰，在髓核區(qū)域無明顯膠原纖維長入。實驗組 HE染色顯示內層纖維環(huán)明顯增生，而髓核區(qū)域相應減小，增生的大

9、量纖維環(huán)樣組織源于軟骨終板，呈纖維軟骨樣外觀；而外層纖維環(huán)則喪失了其完整的層狀結構；天狼星紅染色顯示實驗組新生的雙折光膠原纖維起自軟骨終板，侵入髓核組織內，增厚的后纖維環(huán)喪失了纖維環(huán)的正常層狀結構，表現出雜亂的組織結構。正中矢狀位切面上“功能性”髓核及纖維環(huán)寬度測量結果表明，實驗組前纖維環(huán)與后纖維環(huán)寬度較對照組分別增加了26.5%和37.6%；而髓核寬度較對照組減少14.5%。各組間比較均有顯著性差異（P<0.05）。
　　結論：

10、本研究中直立體位下無創(chuàng)性軸向加載方式可顯著加速兔腰椎間盤的退變進程，表現為實驗組動物中、下段腰椎MRI影像中髓核含水量較對照組降低；實驗組I型膠原表達升高，而II性膠原及蛋白多糖較對照組表達降低；實驗組髓核組織內大量纖維軟骨樣組織長入，纖維環(huán)增厚，而髓核區(qū)域較對照組變小，均為典型的椎間盤退變早期征象。本研究建立的兔椎間盤退變模型在發(fā)病機理上與人類椎間盤退變更加相似，有望為該領域的研究提供更為合理的動物模型。
　　第二部分積累性軸向

11、載荷致兔腰椎間盤退變的過程觀察及機制探索
　　目的：以軸向應力致兔腰椎間盤退變體內模型為研究對象，探索長期軸向載荷刺激下椎間盤退變的病理過程以及相關機制。
　　方法：20只4月齡新西蘭兔隨機分為實驗組（n=12）和對照組（n=8），實驗組動物按照第一部分直立體位下軸向載荷體內造模方法建立兔腰椎間盤退變模型，8只對照組動物同期常規(guī)飼養(yǎng)，另設4只24月老齡兔同期飼養(yǎng)用于與年齡相關性退變比較。于造模前及造模開始后6周、12周及24

12、周行MRI檢查，觀察各組椎間盤水合狀態(tài)，分析椎間盤退變進程。實驗組與對照組分別于造模后12周及24周取材，老齡組于24周后取材，對L5-6節(jié)段髓核組織行real-time PCR檢測，比較各組動物髓核組織基質基因I型膠原、II型膠原、蛋白多糖以及合成/分解代謝相關基因BMP-7、MMP-3、TIMP-1的表達水平；對取材標本L6-7節(jié)段行正中矢狀位組織病理學切片，HE、天狼星紅染色觀察退變椎間盤的病理學改變。綜合評估長期積累性軸向載荷導

13、致椎間盤退變過程中發(fā)生的組織結構以及分子生物學改變。
　　結果：3只實驗組動物分別在實驗進行至6周、9周及20周時死亡，其相應的實驗數據從結果中剔除。實驗組剩余的9只動物對實驗處理耐受良好。MRI結果顯示在上腰椎（L2-3節(jié)段），實驗組與對照組動物腰椎髓核組織信號強度在24周觀察期內均未見顯著改變，仍保持較高的含水量。在中段腰椎及下腰椎（L4-5及 L6-7節(jié)段），對照組24周觀察期內仍未見顯著信號改變；而實驗組從12周即可見明顯

14、信號減低，24周時改變更為明顯。老齡組上、中、下段腰椎間盤信號均較低，24周后信號改變不明顯。Realtime-PCR結果顯示實驗組髓核組織I型膠原mRNA表達較對照組和老齡組明顯增加，而 II型膠原及蛋白多糖表達較對照組和老齡組明顯減少；實驗組合成代謝相關基因BMP-7及分解代謝相關基因MMP-3表達較對照組和老齡組均明顯升高，而組織金屬蛋白酶抑制因子 TIMP-1表達較對照組和老齡組明顯降低。與對照組相比，實驗組12周病理結果顯示纖

15、維軟骨樣組織自終板長入髓核組織，后纖維環(huán)增厚，髓核區(qū)域被分隔；24周時上述病理改變更為明顯，長入髓核組織內的纖維軟骨樣組織已分化為成熟纖維環(huán)結構，髓核組織區(qū)域進一步減少；30月齡兔椎間盤病理改變表現為整個髓核組織發(fā)生纖維化，髓核區(qū)域內無明顯膠凍樣組織結構，但纖維環(huán)排列則較為規(guī)整。髓核脊索細胞 CK18免疫組化染色顯示對照組髓核組織內廣泛分布成簇存在的脊索細胞，而實驗組髓核內脊索細胞特異性抗原 CK18陽性表達細胞簇較對照組明顯減少，髓核

16、組織中央區(qū)域出現較多的單個存在的小軟骨細胞樣髓核細胞，而外周區(qū)域髓核組織則被上下軟骨終板發(fā)出的纖維軟骨樣組織取代。
　　結論：本研究采用的軸向載荷的長期作用可使兔腰椎間盤發(fā)生進行性退變，尤其在下腰椎，實驗組24周載荷作用后，其腰椎間盤水合狀態(tài)與30月齡老齡兔相應節(jié)段相當。髓核基質成分基因表達水平隨年齡變化較小，但對機械載荷刺激非常敏感。腰椎在高載荷作用下，其髓核內合成及分解代謝均較為活躍，這可能是椎間盤內組織細胞結構改變的分子生物

17、學基礎。長期軸向載荷作用會導致腰椎上、下軟骨終板產生大量纖維軟骨樣組織長入髓核，將髓核組織分隔并逐步取代，形成成熟的纖維環(huán)樣結構，然而后纖維環(huán)自身完整的層狀結構喪失，并有髓核組織滲入后纖維環(huán)外層，成為椎間盤突出的病理基礎；老齡組椎間盤內膠凍狀髓核組織亦顯著變小，但纖維環(huán)的層狀結構正常。軸向載荷刺激可導致髓核內脊索細胞特異性抗原CK18陽性表達細胞簇較對照組明顯減少，髓核組織中央區(qū)域出現較多的單個存在的小軟骨細胞樣髓核細胞，而外周區(qū)域髓核