E2-ER-α調(diào)控IGFBP2促進肺淋巴血管平滑肌瘤生長轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、結(jié)節(jié)性硬化癥（Tuberous Sclerosis Complex，TSC）是一種由于 TSC-1或TSC-2基因突變引起的全身多系統(tǒng)受累的常染色體顯性遺傳的綜合癥，機體TSC-1和TSC-2基因突變，導致其分別編碼腫瘤抑制因子錯構(gòu)素蛋白（hamartin）和馬鈴薯球蛋白（ tuberin）表達異常，激活下游雷帕霉素靶蛋白復合物1（mechanistic target of rapamycin complex1，mTORC1）通路，伴隨

2、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、雌激素受體α（estrogen receptorα, ER-α）、磷脂酰肌醇3-激酶（phospho inositide3-kinase，PI3K）和磷酸化S6核糖體蛋白激酶（Phospho-S6 Ribosomal Protein，P-S6）等多種信號通路的異常，從而導致細胞增殖生長、分化、自噬、凋亡等失控。由于其累及

3、組織和器官廣泛，癥狀也復雜多樣，臨床可表現(xiàn)為肺、心臟、腦、腎臟、皮膚面部、視網(wǎng)膜等多器官的“良性”腫瘤，最終造成多器官功能衰竭而導致死亡，嚴重危害人類健康。
　　肺淋巴血管平滑肌瘤（lymphangioleiomyomatosis，LAM）是TSC在肺部的主要并發(fā)癥，多見于育齡期或絕經(jīng)前女性。臨床癥狀缺乏特異性，主要表現(xiàn)為進行性的呼吸困難、咳血、自發(fā)性氣胸和乳糜胸等。由于LAM早期癥狀不典型，臨床確診有賴于肺穿刺組織病理學檢查，典

4、型的病理特征為異常增殖的平滑肌細胞侵潤肺組織，累及淋巴管、血管和氣管，可阻塞氣道和淋巴管，引起淋巴管異常擴張和肺囊性變，晚期形成結(jié)節(jié)、肺泡廣泛囊性擴張，導致呼吸衰竭。
　　鑒于LAM常見于育齡期女性，推測雌激素可能促進了LAM的發(fā)生發(fā)展，臨床治療采取卵巢切除，服用雌激素受體拮抗劑等，取得較好臨床療效，但個體差異較大。研究表明LAM發(fā)病機制關鍵在于TSC2基因缺失致mTORC1通路異常激活，靶向mTORC1通路抑制劑雷帕霉素（Rap

5、amycin）已于2015年5月被美國食品與藥品管理局（FDA）批準用于 LAM的治療，可顯著改善 LAM患者的肺功能。但在后續(xù)的臨床試驗隨訪中卻發(fā)現(xiàn)停用雷帕霉素治療后，LAM患者的肺功能又繼續(xù)惡化。因而，繼續(xù)深入探究LAM發(fā)生發(fā)展的機制，探索更有效的治療具有重要的臨床意義。
　　目前，LAM細胞的確切起源尚不清楚，對散發(fā)和復發(fā)的 LAM患者進行的遺傳學分析提示LAM細胞可能通過潛在的轉(zhuǎn)移途徑遷移到靶器官，臨床上LAM患者進行肺移

6、植術(shù)后仍能復發(fā)，越來越多的循證醫(yī)學證據(jù)都表明LAM可能是一種轉(zhuǎn)移性腫瘤疾病。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2（Insulin-like growth factor binding protein2，IGFBP2）屬于IGFBP超家族，其與胰島素樣生長因子（IGF-Ⅰ和-Ⅱ）有很高的親和力，還參與整合素、VEGF、NF-κB、ERK1/2等通路的激活，與腫瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移，誘導腫瘤血管形成，腫瘤凋亡，雌激素的調(diào)節(jié)都有密切聯(lián)系，已經(jīng)作為乳腺癌、卵

7、巢癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、肺癌、前列腺癌和胃癌等腫瘤療效和預后的標志物之一，有望成為最有潛力的腫瘤治療的候選靶點之一。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)相對于正常肺組織，IGFBP2和ER-α在人LAM組織中高表達，雌二醇（estradiol，E2）促進了LAM的生長和轉(zhuǎn)移，提示E2/ER-α可能通過調(diào)控IGFBP2促進LAM發(fā)生發(fā)展。本研究旨在探究LAM的發(fā)生轉(zhuǎn)移機制，探究E2/ER-α是否調(diào)控IGFBP2促進LAM發(fā)生發(fā)展及其可能的調(diào)控機制

8、，篩選并鑒定潛在的有效治療靶點，為提高LAM的臨床療效提供新的策略。在前期研究基礎上，擬進一步探究LAM組織中IGFBP2表達水平及其與臨床參數(shù)和預后的相關性，并分析其與ER-α表達的相關性，初步探究IGFBP2介導E2/ER-α促進LAM生長轉(zhuǎn)移及其作用機制。研究證實LAM發(fā)病機制關鍵在于TSC2基因缺失，前期成功構(gòu)建人LAM原代細胞（621-101 TSC2-和621-103 TSC2+細胞），進一步體外實驗研究，以人LAM細胞（6

9、21-101 TSC2–ER-α-）為研究對象，通過轉(zhuǎn)染ER-α表達載體，上調(diào)ER-α基因表達，探究E2/ER-α調(diào)控LAM細胞中IGFBP2的表達以及可能的機制；沉默IGFBP2基因表達，評價IGFBP2對人LAM621-101細胞生長增殖，存活，侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學功能的影響。同時，以ELT3細胞（TSC2-），替代人LAM細胞621-101（難以形成移植瘤）構(gòu)建CB17-SCID小鼠移植瘤模型，體內(nèi)試驗進一步探究E2/ER-α調(diào)控I

10、GFBP2促進移植瘤的生長。
　　第一部分：正常肺組織和LAM組織中IGFBP2和ER-α的表達及臨床病理學意義
　　方法：
　　1. Western blot和Real time-PCR聯(lián)合檢測21例正常肺組織和21例LAM組織中IGFBP2蛋白和mRNA的表達、以及P-S6蛋白的表達。
　　2.組織免疫熒光法檢測LAM組織中IGFBP2和P-S6的細胞定位表達。
　　3.免疫組織化學法檢測LAM組織中I

11、GFBP2、α-actin、ER-α和P-S6的表達。
　　4.根據(jù)免疫組化結(jié)果，分析 ER-α表達和 IGFBP2蛋白表達相關性及其與LAM臨床病理參數(shù)的關系。
　　5.統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism6.0軟件進行數(shù)據(jù)的相關分析和統(tǒng)計，兩分類變量的差異比較采用Pearson’sχ2檢驗；兩有序變量之間的相關性檢驗采用Spearman等級相關分析，采用t檢驗統(tǒng)計確定兩組均數(shù)之間的差異，以α=0.05為

12、顯著性檢驗水準。
　　結(jié)果：
　　1. Western blot和Real time-PCR聯(lián)合檢測結(jié)果顯示：LAM組織中與正常肺組織中IGFBP2的蛋白和mRNA相對表達增加2倍以上的比率分別為71.43％、14.29%、76.19%和19.05%，LAM組織中P-S6蛋白表達顯著高于正常肺組織；組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2.組織免疫熒光結(jié)果顯示：LAM組織中IGFBP2蛋白表達主要定位于細胞

13、核，P-S6蛋白表達主要定位于細胞膜和細胞漿。
　　3.免疫組織化學檢測結(jié)果顯示：LAM組織中α-actin和 P-S6蛋白陽性率100%，進一步輔助LAM的組織病理學診斷。ER-α蛋白和IGFBP2蛋白主要是細胞核表達，ER-α在LAM組織中表達陽性率顯著增加，IGFBP2在正常肺組織、ER-α陰性LAM組織和ER-α陽性LAM中陽性表達率分別為4.76%、33.33%和88.89%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

14、　　4.根據(jù)免疫組化結(jié)果，在LAM組織中IGFBP2蛋白表達與患者年齡、病灶大小比較均未見相關性（P>0.05），與肺功能下降相關（P<0.05），提示IGFBP2可能是 LAM患者預后相關的生物標志物；Spearman等級相關分析結(jié)果表明ER-α的表達和IGFBP2的表達呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.人LAM組織中IGFBP2蛋白和mRNA表達顯著高于正常肺組織，蛋白主要定位于胞核表達，

15、其高表達與 LAM患者肺功能下降相關，可能是預測LAM臨床不良預后的一個潛在生物標志物。
　　2.人LAM組織中IGFBP2表達與ER-α陽性表達正相關，提示IGFBP2可能參與E2/ER-α促進LAM的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。
　　第二部分：E2/ER-α調(diào)控人LAM細胞621-101中 IGFBP2的表達
　　方法：
　　1. Western blot檢測人LAM細胞621-101（TSC2-）和621-103（TS

16、C2+）中IGFPP2的表達
　　2.在人 LAM細胞621-101（TSC2-）中，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-ER-α表達載體， Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率；
　　3. Western blot分別檢測對照組、轉(zhuǎn)染ER-α組、轉(zhuǎn)染ER-α聯(lián)合E2（刺激24h）組細胞IGFBP2蛋白表達水平的變化。
　　4.細胞免疫熒光法分別檢測對照組、轉(zhuǎn)染ER-α組、轉(zhuǎn)染ER-α聯(lián)合E2（刺激24h）組細胞IGFBP2蛋白在細

17、胞內(nèi)表達分布的情況。
　　5.統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism6.0軟件進行數(shù)據(jù)的分析和統(tǒng)計，兩分類變量的差異比較采用Pearson’sχ2檢驗；采用t檢驗統(tǒng)計確定兩組均數(shù)之間的差異，以α=0.05為顯著性檢驗水準。
　　結(jié)果：
　　1. Western blot結(jié)果顯示：與621-103細胞（TSC2+））相比，IGFBP2在621-101（TSC2-）細胞中蛋白表達顯著增加。
　　2.

18、Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比，轉(zhuǎn)染ER-α組，ER-α蛋白表達顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），成功構(gòu)建621-101 ER-α+細胞，為后續(xù)研究提供靶細胞。
　　3. Western bolt結(jié)果顯示：對照組、轉(zhuǎn)染ER-α組、轉(zhuǎn)染ER-α聯(lián)合E2組，三組IGFBP2蛋白表達沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　4.細胞免疫熒光結(jié)果顯示，對照組與轉(zhuǎn)染ER-α組，IGFBP2表達定位主要位于細胞膜

19、和細胞漿，轉(zhuǎn)染ER-α聯(lián)合E2組，IGFBP2表達定位主要分布于細胞核，表明E2/ER-α促進IGFBP2核表達。
　　5. Western bolt結(jié)果顯示：與對照組和轉(zhuǎn)染ER-α組相比、轉(zhuǎn)染ER-α聯(lián)合E2組細胞中IGFBP2細胞核表達較高，差異有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.人LAM細胞中IGFBP2高表達，提示在LAM細胞中，TSC2可能參與IGFBP2的調(diào)控。
　　2.成功構(gòu)建人LA

20、M621-101 TSC2-ER-α+細胞，E2刺激24h,能促進621-101 TSC2-ER-α+細胞中IGFBP2的核表達，提示E2/ER-α通路可能調(diào)控IGFBP2的核表達促進LAM的發(fā)生發(fā)展。
　　第三部分：siRNA沉默IGFBP2表達對人LAM621-101細胞生物學功能的影響
　　方法：
　　1. siRNA IGFBP2轉(zhuǎn)染621-101細胞，Western blot和Real time PCR檢測轉(zhuǎn)

21、染效率。
　　2.沉默IGFBP2表達，MTT法檢測細胞增殖。
　　3.沉默IGFBP2表達，PI拒染法檢測細胞存活率。
　　4.沉默IGFBP2表達，Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力。
　　5.沉默IGFBP2表達，Western blot法檢測p-ERK1/2的蛋白表達影響。
　　6. mTOR通路抑制劑雷帕霉素和ERK1/2通路抑制劑AZD6244單藥或聯(lián)合處理621-101細胞，Weste

22、rn blot檢測對p-ERK1/2、IGFBP2和P-S6蛋白表達。
　　7.統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism6.0軟件進行數(shù)據(jù)的分析和統(tǒng)計，兩分類變量的差異比較采用Pearson’sχ2檢驗；采用t檢驗統(tǒng)計確定兩組均數(shù)之間的差異，以α=0.05為顯著性檢驗水準。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比，siRNA轉(zhuǎn)染組IGFBP2蛋白和mRNA表達降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

23、　　2.與對照組相比，E2能促進621-101細胞的增殖，沉默IGFBP2表達能抑制E2的促增殖作用（P<0.05）。
　　3.與對照組相比，E2能減少621-101細胞的死亡，沉默IGFBP2表達能抑制E2的促存活作用（P<0.05）。
　　4.與對照組相比，siRNA IGFBP2組細胞遷移和侵襲能力降低（P<0.05）。
　　5.與對照組相比，siRNA IGFBP2能抑制p-ERK1/2表達。
　　6.雷

24、帕霉素能降低P-S6蛋白表達；AZD6244降低p-ERK1/2蛋白表達，增加P-S6表達；雷帕霉素和AZD6244單藥或聯(lián)合均不影響IGFBP2的蛋白表達。
　　小結(jié)：
　　1. E2能促進621-101細胞的增殖和降低細胞死亡，沉默IGFBP2表達能抑制E2的促增殖和促存活作用、抑制621-101細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。體外實驗結(jié)果提示IGFBP2可能介導E2/ER-α促LAM的生長和轉(zhuǎn)移。
　　2.沉默IGFBP2表達

25、可以降低p-ERK1/2的表達，表明IGFBP2參與LAM的發(fā)生發(fā)展，可能與激活p-ERK1/2通路有關。
　　3. mTOR通路抑制劑雷帕霉素和ERK1/2通路抑制劑AZD6244單藥或聯(lián)合處理均不能抑制IGFBP2的表達，沉默IGFBP2的表達可以降低p-ERK1/2的表達，提示p-ERK1/2可能是IGFBP2的下游靶點。
　　第四部分：體內(nèi)實驗驗證E2/ER-α調(diào)控IGFBP2促進ELT3 TSC2-細胞移植瘤的生長

26、
　　方法：
　　1.建立ELT3 TSC2-細胞來源的CB17-SCID小鼠移植瘤模型，比較E2治療組和安慰劑組移植瘤體生長的差異。
　　2.免疫組織化學法檢測E2治療組和安慰劑組移植瘤中IGFBP2、α-actin蛋白的表達。
　　3.組織免疫熒光法檢測E2治療組和安慰劑組移植瘤中IGFBP2蛋白和P-S6蛋白表達定位的變化。
　　4. Western blot法檢測E2治療組和安慰劑組細胞核和細胞漿中

27、IGFBP2的表達。
　　5.統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism6.0軟件進行數(shù)據(jù)的分析和統(tǒng)計，兩分類變量的差異比較采用Pearson’sχ2檢驗；采用t檢驗統(tǒng)計確定兩組均數(shù)之間的差異，以α=0.05為顯著性檢驗水準。
　　結(jié)果：
　　1.與安慰劑組相比，E2治療組移植瘤生長明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2.免疫組織化學法檢測結(jié)果顯示：E2治療組和安慰劑組中IGFBP2蛋

28、白陽性率分別為80%和20%，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3.組織免疫熒光檢測結(jié)果顯示：安慰劑組和E2治療組細胞中P-S6主要是胞漿和胞膜表達，表達分布沒有差異。與安慰劑組相比，E2治療組 IGFBP2蛋白胞核表達顯著增多，E2顯著促進IGFBP2的核表達。
　　4. Western blot法檢測結(jié)果顯示：與安慰劑組相比， E2治療組細胞核中IGFBP2表達較高，細胞漿中表達較低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P

29、<0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.體內(nèi)實驗表明，E2能增加ELT3細胞移植瘤IGFBP2基因的蛋白表達，促進移植瘤的生長。
　　2.體內(nèi)實驗表明，E2/ER-α能促進 IGFBP2的核表達，IGFBP2可能是E2/ER-α的效應基因，介導 E2/ER-α促進LAM的發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)論：
　　1.前期研究表明E2能促進LAM的生長和轉(zhuǎn)移，本研究發(fā)現(xiàn),與正常肺組織相比，LAM組織中IGFBP2蛋白和mRNA

30、高表達, IGFBP2蛋白胞核表達與ER-α表達正相關，提示IGFBP2可能參與E2/ER-α促進LAM的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，且IGFBP2高表達與LAM肺功能下降密切相關，可能是LAM一個潛在的預后評價指標。
　　2.成功構(gòu)建621-101 TSC2-ER-α+細胞，證實E2/ER-α能促進 IGFBP2的核表達，提示E2/ER-α可能調(diào)控IGFBP2細胞核表達促進LAM的發(fā)生發(fā)展。
　　3. E2能促進621-101細胞的增