人iPSCs誘導類肝細胞及其用于中藥肝毒性評價的初步研究.pdf

1、目的:
　　1.建立人iPSCs誘導類肝細胞模型。
　　2.初步評價人iPSCs誘導類肝細胞在中藥肝毒性檢測中的應用。
　　方法:
　　1.人iPSCs誘導類肝細胞的細胞因子4階段誘導分化方法:第1階段，內(nèi)胚層細胞的誘導，即在人iPSCs中加入100 ng/mL激活素A(Activin A)、10 ng/mL骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)、20 ng/mL成纖維生長因子-2(FGF-2)、2％ B27和1640

2、細胞培養(yǎng)液，每天換誘導培養(yǎng)液，一共8天;第2階段，內(nèi)胚層細胞向類肝細胞的分化，即加入20 ng/mL BMP-4、10 ng/mL FGF-2、2％ B27和1640細胞培養(yǎng)液，每天換誘導培養(yǎng)液，一共5天;第3階段，類肝細胞的擴增，即加入20 ng/mL肝細胞生長因子(HGF)、2％ B27和1640細胞培養(yǎng)液，每天換誘導培養(yǎng)液，一共5天;第4階段，類肝細胞的成熟，加入HCM和20 ng/mL制瘤素M(Oncostat in M)，每天

3、換誘導培養(yǎng)液，一共5天。用倒置熒光顯微鏡拍攝人iPSCs的誘導過程中細胞形態(tài)動態(tài)變化，觀察人iPSCs誘導類肝細胞是否具有肝細胞的形態(tài)。
　　2.免疫細胞化學染色(immunofluorescence staining):用4％濃度的多聚甲醛固定細胞，然后用0.5％ Triton在細胞表面穿孔，用山羊血清封閉1個小時，加入1％BSA稀釋的一抗，37℃雜交2個小時，避光放置在4℃過夜，加入的1％BSA稀釋的二抗，放置在37℃，雜交1

4、個小時。加入5μg/mL的DAPI染核，拿到熒光顯微鏡下拍照并保存圖片。觀察人iPSCs誘導類肝細胞過程中的特異性蛋白:倒置熒光顯微鏡觀察誘導過程中的第8天后限定性內(nèi)胚層特異性蛋白叉頭框轉(zhuǎn)錄因子A2(FOXA2)和性別決定區(qū)Y框蛋白17(SOX17)的表達情況，看其是否表達來確定內(nèi)胚層細胞是否誘導成功;第18天后肝細胞特異性蛋白甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表達情況，看其是否表達來確定類肝細胞是否形成;第23天后成熟肝細胞功能蛋

5、白α1-抗胰蛋白酶（AAT）、肝細胞色素P4503A4(CYP3A4)的表達情況，看其是否表達來確定誘導后的類肝細胞是否具有人成熟肝細胞的主要功能特異性蛋白。
　　3.實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR):提取總RNA，然后按照試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，使用7500 PCR儀檢測。檢測誘導第23天后肝細胞特異性基因細胞角蛋白8(CK8)、細胞角蛋白18(CK18)、細胞角蛋白19(CK19)、AFP、ALB的表達，觀察誘導

6、后的類肝細胞的人肝細胞是否表達人成熟肝細胞的主要基因。
　　4.吲哚青綠(ICG)攝取實驗:第23天將ICG加入到類肝細胞中，37℃孵育1h，光學顯微鏡下觀察ICG是否被誘導后的類肝細胞攝取以確定誘導后的類肝細胞是否具有肝細胞的特異性功能。
　　5.雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導類肝細胞的肝功能的影響:誘導完成后，在成功誘導好的類肝細胞中加入雷公藤凍干粉0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg

7、/mL，在37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取細胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法，用酶標儀在570 nm檢測OD值并計算谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性，取細胞按照試劑盒操作方法，用酶標儀在532 nm檢測OD值并計算丙二醛(MDA)的濃度，在410 nm檢測OD值并計算谷胱甘肽(GSH)的濃度和在450 nm檢測OD值并計算超氧化物歧化酶(SOD)的活性，初步評價雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導類肝細胞的肝毒性作用

8、。
　　6.雷公藤凍干粉對LO2細胞的肝功能的影響:誘導完成后，在LO2細胞中加入雷公藤凍干粉0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL，在37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取細胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法，用酶標儀在570 nm檢測OD值并計算ALT、AST的活性，取細胞按照試劑盒操作方法，用酶標儀在532 nm檢測OD值并計算MDA的濃度，在410 nm檢測OD值并計算GSH的濃

9、度和在450 nm檢測OD值并計算SOD的活性，初步評價雷公藤凍干粉對LO2細胞的肝毒性作用。
　　7.雷公藤甲素對人iPSCs類肝細胞的肝功能的影響:誘導完成后，在成功誘導好的類肝細胞中加入雷公藤甲素0 mg/mL、2 mg/mL、6 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL，在37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取細胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法，用酶標儀在570 nm檢測OD值并計算ALT、AST的活性，取細胞

10、按照試劑盒操作方法，用酶標儀在532 nm檢測OD值并計算MDA的濃度，在410 nm檢測OD值并計算GSH的濃度和在450 nm檢測OD值并計算SOD的活性，初步評價雷公藤甲素對人iPSCs誘導類肝細胞的肝毒性作用。
　　8.雷公藤甲素對LO2細胞的肝功能的影響:誘導完成后，在LO2細胞中加入雷公藤甲素0 mg/mL、2 mg/mL、6 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL，在37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24

11、h，取細胞培養(yǎng)上清按照試劑盒操作方法，用酶標儀在570 nm檢測OD值并計算ALT、AST的活性，取細胞按照試劑盒操作方法，用酶標儀在532 nm檢測OD值并計算MDA的濃度，在410 nm檢測OD值并計算GSH的濃度和在450 nm檢測OD值并計算SOD的活性，初步評價雷公藤甲素對LO2細胞的肝毒性作用。
　　9.雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導類肝細胞和LO2細胞的肝功能的影響比較對比雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導類肝細胞與雷公

12、藤凍干粉對LO2細胞的肝毒性作用，初步評價人iPSCs誘導的類肝細胞在中藥肝毒性檢測中的應用。
　　10.雷公藤甲素對人iPSCs誘導類肝細胞和LO2細胞的肝功能的影響比較對比雷公藤甲素對人iPSCs誘導類肝細胞與雷公藤甲素對LO2細胞的肝毒性作用，初步評價人iPSCs誘導類肝細胞在中藥肝毒性檢測中的應用。
　　結果:
　　1.人iPSCs誘導類肝細胞分化過程中的細胞形態(tài)動態(tài)變化:倒置熒光顯微鏡光學圖片顯示，誘導的第0

13、d的人iPSCs呈克隆團塊樣生長，每個克隆團塊由多個單個細胞相互密集契合組成，單個細胞的大小、形狀不一致，邊緣棱角清晰;誘導的第3d，相對于第0d，克隆內(nèi)的細胞逐漸變大，形態(tài)逐漸變圓;誘導第12 d，可觀察到相對于第3d，克隆內(nèi)的細胞變大，形狀趨于一致，棱角逐漸不明顯;誘導第23 d，克隆內(nèi)的大部分細胞變成大小、形狀均一的多邊形細胞，細胞呈鋪路石樣整齊排列。說明人iPSCs誘導類肝細胞具有人肝細胞的形態(tài)。
　　2.免疫細胞化學染色

14、結果:免疫細胞化學染色檢測結果顯示限定性內(nèi)胚層特異性蛋白FoxA2和Sox17在內(nèi)胚層細胞誘導階段有表達，誘導率均為80％左右，說明內(nèi)胚層細胞誘導成功;肝細胞特異性蛋白AFP和ALB在人iPSCs向類肝細胞分化階段和類肝細胞增殖階段有表達，誘導率均為90％左右，說明類肝細胞已經(jīng)形成;肝細胞功能性蛋白AAT和CYP3A4在類肝細胞成熟階段有表達，誘導率分別為80％和90％左右，說明人iPSCs誘導類肝細胞具有人成熟肝細胞的主要功能特異性蛋

15、白。
　　3.qPCR對人肝特異性基因的檢測結果:qPCR檢測結果顯示肝細胞特異性基因CK8、CK18、CK19、AFP、ALB在類肝細胞中有表達，相對于誘導前的細胞，人iPSCs誘導類肝細胞基因表達率明顯升高。
　　4.ICG攝取實驗結果:ICG攝取實驗顯示誘導后的類肝細胞被染成綠色，說明人iPSCs誘導類肝細胞具有人肝細胞的特異性功能。
　　5.雷公藤凍干粉對人iPSCs源的肝細胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的

16、對照組比較，雷公藤凍干粉的1，2，4，8 mg/mL各干預組細胞培養(yǎng)液上清中的ALT和AST含量顯著升高，呈劑量正相關性，差異具有統(tǒng)計學意義;細胞中MDA的濃度顯著升高，呈劑量正相關性，差異具有統(tǒng)計學意義;細胞中GSH的濃度和SOD的活性顯著降低，呈劑量負相關性，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　6.雷公藤凍干粉對LO2細胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的對照組比較，雷公藤凍干粉的1，2，4，8 mg/mL各干預組細胞培養(yǎng)液上清中的AL

17、T和AST含量顯著升高，呈劑量正相關性，差異具有統(tǒng)計學意義;細胞中MDA的濃度顯著升高，呈劑量正相關性，差異具有統(tǒng)計學意義;細胞中GSH的濃度和SOD的活性顯著降低，呈劑量負相關性，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　7.雷公藤甲素對人iPSCs源的肝細胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的對照組比較，雷公藤甲素的2，6，10，20 mg/mL各干預組細胞培養(yǎng)液上清中的ALT和AST含量顯著升高，呈劑量正相關性，差異具有統(tǒng)計學意義;細胞中MD

18、A的濃度顯著升高，呈劑量正相關性，差異具有統(tǒng)計學意義;細胞中GSH的濃度和SOD的活性顯著降低，呈劑量負相關性，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　8.雷公藤甲素對LO2細胞的肝功能的影響:與0 mg/mL的對照組比較，雷公藤凍干粉的1，2，4，8 mg/mL各干預組細胞培養(yǎng)液上清中的ALT和AST含量顯著升高，呈劑量正相關性，差異具有統(tǒng)計學意義;細胞中MDA的濃度顯著升高，呈劑量正相關性，差異具有統(tǒng)計學意義;細胞中GSH的濃度和SOD的活

19、性顯著降低，呈劑量負相關性，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　9.雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導類肝細胞和LO2細胞的肝功能的影響比較:人iPSCs誘導類肝細胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高，呈劑量正相關性，LO2細胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高，呈劑量正相關性，雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導類肝細胞膜毒性與雷公藤凍干粉對LO2細胞的肝細胞膜毒性的作用趨勢一致;人iPSCs誘導類肝

20、細胞中MDA濃度隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高，呈劑量正相關性，LO2細胞上清中MDA濃度隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高，呈劑量正相關性，雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導類肝細胞膜脂質(zhì)過氧化毒性與雷公藤凍干粉對LO2細胞的肝細胞膜膜脂質(zhì)過氧化毒性的作用趨勢一致;人iPSCs誘導類肝細胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而升高，呈劑量負相關性，LO2細胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤凍干粉濃度的增高而

21、升高，呈劑量負相關性，雷公藤凍干粉對人iPSCs誘導類肝細胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性與雷公藤凍干粉對LO2細胞的肝細胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性的作用趨勢一致。
　　10.雷公藤甲素對人iPSCs誘導類肝細胞和LO2細胞的肝功能的影響比較:人iPSCs誘導類肝細胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈劑量正相關性，LO2細胞上清中的ALT和AST含量隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈劑量正相關性，雷公藤甲素對人iPSC

22、s誘導類肝細胞膜毒性與雷公藤甲素對LO2細胞的肝細胞膜毒性的作用趨勢一致;人iPSCs誘導類肝細胞中MDA濃度隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈劑量正相關性，LO2細胞上清中MDA濃度隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈劑量正相關性，雷公藤甲素對人iPSCs誘導類肝細胞膜脂質(zhì)過氧化毒性與雷公藤甲素對LO2細胞的肝細胞膜膜脂質(zhì)過氧化毒性的作用趨勢一致;人iPSCs誘導類肝細胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈

23、劑量負相關性，LO2細胞上清中的GSH的濃度和SOD活性隨著雷公藤甲素濃度的增高而升高，呈劑量負相關性，雷公藤甲素對人iPSCs誘導類肝細胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性與雷公藤凍干粉對LO2細胞的肝細胞內(nèi)氧自由基清除酶毒性的作用趨勢一致。
　　結論:
　　1.人iPSCs細胞因子四步誘導分化方法可以將人誘導多能干細胞誘導分化成類肝細胞，分化成的類肝細胞具有肝細胞的形態(tài)，肝細胞的特異性蛋白，基因，肝細胞的特異性功能。
　　2.雷