沉默調(diào)節(jié)蛋白3下調(diào)促發(fā)肥胖小鼠和病人內(nèi)皮胰島素抵抗及血管功能障礙.pdf

1、研究背景：
　　肥胖已成為全球性的、嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球目前至少有10億成年人超重，3億人肥胖。肥胖是導(dǎo)致高血壓、冠心病及糖尿病等多種慢性病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。近年的研究表明，內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等血管病變的早期表現(xiàn)，處于心血管事件鏈的始動(dòng)環(huán)節(jié)；而內(nèi)皮胰島素敏感性對(duì)內(nèi)皮和血管功能的維持具有重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均顯示，血管內(nèi)皮胰島素抵抗可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，而改善內(nèi)皮胰島素敏感性可提高內(nèi)皮

2、功能、減輕心血管損傷。然而，肥胖是否引起內(nèi)皮胰島素抵抗及內(nèi)皮功能障礙，引起內(nèi)皮胰島素抵抗的原因是什么？目前仍不清楚。
　　生理情況下，線粒體活性氧族（mitochondrial ROS，mtROS）參與血管穩(wěn)態(tài)維持及血管功能調(diào)節(jié)，然而在病理情況下，過量的mtROS產(chǎn)生會(huì)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷信號(hào)并導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。沉默調(diào)節(jié)蛋白3（sirtuin3，SIRT3）是線粒體中NAD+依賴的一種去乙?；福饕S持線粒體代謝和氧化還原平衡。

3、研究顯示，代謝綜合征、衰老及肺動(dòng)脈高壓等疾病均與 SIRT3下調(diào)有關(guān)。然而，SIRT3在內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)與血管功能維持中的作用和意義目前尚不清楚。我們初步研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠和肥胖患者的血管中SIRT3表達(dá)下降，這提示我們SIRT3可能參與了肥胖引起的內(nèi)皮功能障礙，本研究旨在進(jìn)一步明確SIRT3在內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)與血管胰島素敏感性維持中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.明確SIRT3是否參與肥胖引起的血管內(nèi)皮胰島素抵抗；
　　2.如果是

4、，研究肥胖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮胰島素抵抗和血管功能障礙的具體機(jī)制，尤其是SIRT3和mtROS在其中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.我們與西京消化病醫(yī)院合作，選擇了12例擬行減肥手術(shù)的肥胖病人（BMI≥30 kg/m2，HOMA-IR≥3.8）和8例擬行其他腹部手術(shù)（膽囊切除、食管裂孔疝修復(fù)或食道失弛緩癥手術(shù)）的正常體重者（BMI<30 kg/m2，HOMA-IR<3.8）。肥胖組排除標(biāo)準(zhǔn)為已有心血管病史或具有心血管疾病的臨床表現(xiàn)

5、包括充血性心衰、冠心病、高血壓，但不包括2型糖尿病和高脂血癥。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)為糖尿病、高血壓、心血管病史或具有心血管疾病的臨床表現(xiàn)以及其他可能干擾研究的情況。在征得病人同意后術(shù)中取病人少量腸系膜組織，實(shí)驗(yàn)室分離腸系膜動(dòng)脈并制備血管環(huán)，采用DMT610M多通道成像系統(tǒng)檢測(cè)血管舒張功能，采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)SIRT3蛋白表達(dá)。
　　2.為探討肥胖、血管胰島素敏感性及 SIRT3表達(dá)的關(guān)系，我們采用8周齡的雄性129Sv小鼠，高脂飲

6、食飼養(yǎng)24 wk建立肥胖小鼠模型。處死動(dòng)物前，進(jìn)行腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)（IPGTT）和腹腔內(nèi)注射胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（IPITT），分離小鼠主動(dòng)脈檢測(cè)血管舒張功能。首先用苯腎上腺素（PE,10-5M）預(yù)收縮主動(dòng)脈血管環(huán)，并分別加入乙酰膽堿（ACh,10-10-10-5M）、胰島素（10-9-10-6M）和硝普鈉（SNP,10-10-10-5M），記錄血管張力變化。血管舒張結(jié)果表示為舒張張力與預(yù)收縮張力的百分比。
　　3.為明確SIR

7、T3在內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗模型中表達(dá)的變化，我們給予內(nèi)皮細(xì)胞500μM棕櫚酸鹽處理24 h建立高脂誘導(dǎo)的細(xì)胞胰島素抵抗模型，檢測(cè)基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞 Akt、p-Akt（Ser473）、eNOS、p-NOS（Ser1177）及SIRT3蛋白表達(dá)；采用DAF2 DA探針檢測(cè)細(xì)胞一氧化氮（NO）水平，并用Nikon EclipseTi-E倒置顯微鏡采集圖像。利用Griess試劑法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清總NO水平。
　　4.為了進(jìn)

8、一步明確SIRT3與內(nèi)皮胰島素抵抗的關(guān)系，我們利用SIRT3 siRNA或Scramble siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，觀察下調(diào)SIRT3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞胰島素敏感性及NO水平的影響。采用MitoSOX探針檢測(cè)線粒體O2??水平，用共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。采用SIRT3慢病毒（Lv-SIRT3）或陰性對(duì)照慢病毒（Lv-pCMV）感染內(nèi)皮細(xì)胞，觀察過表達(dá)SIRT3蛋白對(duì)棕櫚酸鹽誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗及NO水平的影響。
　　5.采用蛋白免

9、疫印跡方法檢測(cè) SIRT3蛋白表達(dá)水平或錳超氧化物歧化酶（SOD2）和乙?；疭OD2（Lys68）水平（以β-actin作為內(nèi)參）；采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)SIRT3 mRNA水平（以18S rRNA作為內(nèi)參）。
　　6.數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism version5.0程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)；兩組以上數(shù)據(jù)間比較采用方差分析（ANOVA）或重復(fù)測(cè)量方差分析。Western blot灰度值分析采用Kr

10、uskal-Wallis檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤， P<0.05為差異有顯著性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比，肥胖病人腸系膜動(dòng)脈血管SIRT3蛋白表達(dá)降低約40％（P<0.01）；血管對(duì)胰島素的舒張反應(yīng)下降約30%（P<0.05）；
　　2.與正常飲食組相比，給予小鼠高脂飲食24 wk，體重顯著增加（P<0.05），而血管SIRT3蛋白表達(dá)下降為正常飲食組的1/4（P<0.01）。此外，24周齡的o

11、b/ob肥胖小鼠血管SIRT3蛋白表達(dá)也顯著下調(diào)（P<0.05）。與正常飲食的小鼠相比，高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠對(duì)胰島素誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)明顯下降（P<0.01），而兩組血管對(duì)SNP誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)無顯著差別，表明肥胖小鼠出現(xiàn)內(nèi)皮胰島素抵抗。
　　3.與對(duì)照組相比，棕櫚酸鹽處理24 h可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗，表現(xiàn)為胰島素誘導(dǎo)的AktSer473和eNOSSer1177磷酸化下降以及NO釋放減少；基礎(chǔ)狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞Akt和eNOS的蛋

12、白表達(dá)及磷酸化水平無顯著差別。與對(duì)照組相比，棕櫚酸鹽處理內(nèi)皮細(xì)胞4 h和8 h時(shí)SIRT3蛋白表達(dá)有所下降但并不顯著，然而，在給予棕櫚酸鹽處理16 h和24 h后，SIRT3蛋白表達(dá)分別降低約25%和50%，（P<0.01）。
　　4.轉(zhuǎn)染SIRT3 siRNA導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞SIRT3蛋白表達(dá)下降80%，并顯著抑制胰島素誘導(dǎo)的Akt和eNOS磷酸化及NO釋放，提示內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性降低。與陰性對(duì)照慢病毒（Lv-pCMV）相比，

13、SIRT3慢病毒（Lv-SIRT3）感染顯著提高了SIRT3蛋白表達(dá)，改善了棕櫚酸鹽誘導(dǎo)的內(nèi)皮胰島素抵抗，表現(xiàn)為胰島素誘導(dǎo)的Akt及eNOS磷酸化升高，NO釋放增加（P<0.05）。
　　5.IPGTT和 IPITT結(jié)果顯示，SIRT3缺失明顯加重了高脂飲食引起的葡萄糖耐量和胰島素耐量受損。在正常飲食條件下，SIRT3敲除小鼠和野生型小鼠對(duì)胰島素或ACh誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)無顯著差別。但與高脂飲食的野生型小鼠相比，高脂飲食的SIRT

14、3敲除小鼠血管對(duì)胰島素誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)顯著降低（P<0.05），對(duì)ACh誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)也顯著降低（P<0.01）。各組血管對(duì)SNP引起的舒張反應(yīng)無顯著差別，表明SIRT3缺失可加速內(nèi)皮胰島素抵抗，而對(duì)平滑肌的舒張功能無影響。
　　6.與高脂飲食的野生型小鼠相比，高脂飲食的SIRT3敲除小鼠血管mtROS水平顯著升高。棕櫚酸鹽處理或轉(zhuǎn)染SIRT3 siRNA均可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞mtROS水平，而SIRT3慢病毒感染可抑制棕櫚酸鹽誘導(dǎo)的

15、mtROS過量產(chǎn)生。轉(zhuǎn)染SIRT3 siRNA顯著抑制了內(nèi)皮細(xì)胞胰島素刺激的NO產(chǎn)生，而給予mtROS清除劑MitoTEMPO可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞胰島素誘導(dǎo)的NO釋放。利用MitoTEMPO清除mtROS可顯著改善高脂飲食SIRT3敲除小鼠血管對(duì)胰島素的最大舒張反應(yīng)（P<0.01）。與正常飲食組相比，野生型小鼠高脂飲食24 wk后，血管中SOD2蛋白表達(dá)水平?jīng)]有變化，然而其乙?；斤@著增加（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　本課