晚期胃癌行減瘤術(shù)聯(lián)合腹腔熱灌注化療治療后長鏈非編碼RNA的表達譜分析及初步生物信息學研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其在全球癌癥死亡率中排第二。在不同的地區(qū)及人群中胃癌的發(fā)病率有很大的差異，在東亞、東歐及南歐地區(qū)其發(fā)病率較高。其中在東亞地區(qū)，晚期胃癌（advanced gastric cancer,AGC）是癌癥死亡率最高的疾病。雖說近年來，晚期胃癌的發(fā)病率有所下降,由于不能早期診斷及缺乏有效的治療手段使其死亡率仍偏高。大多數(shù)早期胃癌患者經(jīng)合理治療后能夠治愈，或具有較高的長期生存率，但是多數(shù)

2、胃癌患者確診時已是進展期，患者具有極低的長期生存率。超過2/3的進展期胃癌患者在確診時已經(jīng)失去手術(shù)治療的機會，但對于可以行手術(shù)切除的患者，術(shù)后局部區(qū)域復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移仍很高。進展期胃癌患者常見的轉(zhuǎn)移方式有淋巴道轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移以及種植轉(zhuǎn)移，但以腹腔播散轉(zhuǎn)移最為常見，一旦發(fā)生腹腔播散轉(zhuǎn)移，這將導致腹膜轉(zhuǎn)移癌（PC），這也是其生存率較低的原因之一。進展期胃癌發(fā)生腹膜種植轉(zhuǎn)移預示著疾病發(fā)展的終末階段，此時，一般僅能行姑息治療，且治療效果極差。

3、r>　　目前針對于進展期胃癌的治療方法有手術(shù)治療、手術(shù)聯(lián)合放化療以及單純靶向治療。手術(shù)治療是胃癌根治的基石，也是唯一手段。進展期胃癌應該行標準的胃癌根治術(shù)。在輔助化療方面，日本的ACTS．GC研究和韓國CLASSIC研究都證實進展期胃癌(II期和Ⅲ期)行D2根治術(shù)聯(lián)合術(shù)后輔助化療，效果要優(yōu)于單純手術(shù)治療。但是對于發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的AGC患者來說，上述的治療方法療效甚微，目前并沒有特別有效的方法用于治療腹膜轉(zhuǎn)移癌。但是據(jù)一項CRS+HIPEC

4、的回顧性研究報道， AGC行CRS+HIPEC治療后其平均總生存期達到8.9個月。CRS聯(lián)合HIPEC治療AGC被認為是一種有效的治療方法。相關(guān)研究表明，高熱在增強化療藥物藥效的同時也可以增強腫瘤的化療敏感性。由此看來，CRS聯(lián)合HIPEC可能是治療AGC的最佳治療方法。但是該治療方法的具體作用機制是怎么樣的？我們尚未明確，因此，需要我們進一步明確與AGC進展相關(guān)的分子機制。
　　近期的研究表明長鏈非編碼RNA(long nonc

5、oding RNA，lncRNA)具有保守的二級結(jié)構(gòu)，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學過程的調(diào)控，尤其在腫瘤當中發(fā)揮了重要的調(diào)控角色。研究表明，lncRNA的表達異?？蓪е禄虮磉_異常和腫瘤形成。此外，lncRNAs的異常表達已被確認為許多類型癌癥具有的特征，并通過多種機制促進腫瘤的發(fā)展，侵襲和轉(zhuǎn)移。lncRNAs雖被證實參與AGC的發(fā)生發(fā)展，但對其在 AGC行熱灌注化療過程中所起的作用機制的研究甚少。因此，我們猜想A

6、GC行CRS+HIPEC治療后其lncRNA的表達可能在某種程度上發(fā)生變化，致使CRS+HIPEC治療起到一定的療效。為了了解lncRNA在AGC所起到的作用機制，本課題試圖通過對比分析AGC行CRS+HIPEC治療前、后血清樣本中l(wèi)ncRNA的表達譜，找出與之密切相關(guān)的lncRNA，并通過進一步交叉分析mRNA信號通路變化，分析其功能以了解其在 AGC行 CRS+HIPEC治療的過程中所起到的作用機制。
　　研究內(nèi)容與方法：

7、r>　?。?）收集6組行減瘤術(shù)聯(lián)合腹腔熱灌注化療胃癌患者的血清樣本（病理確診為晚期胃腺癌，所有的減瘤術(shù)及腹腔熱灌注化療過程均由同一個團隊按相關(guān)操作標準執(zhí)行。將60mg順鉑及1000mg5-氟尿嘧啶溶于4L生理鹽水中加熱至43℃后行腹腔熱灌注化療（1h））。治療前后分別提取RNA后，利用基因芯片對lncRNA及mRNA進行分析，采用箱型圖、散點圖、火山圖、聚類分析等分析方法，建立胃癌相關(guān)lncRNA及mRNA的差異表達譜。
　　（2

8、）利用生物信息學方法對差異表達的mRNA及l(fā)ncRNA進行聯(lián)合分析，包括lncRNA分類及亞組分析和GO分析，調(diào)控通路分析等。
　?。?）根據(jù)生物學信息結(jié)果，篩選出8條顯著表達異常的lncRNA。采用實時定量PCR方法進一步驗證其在CRS+HIPEC治療后的表達情況。
　　實驗結(jié)果：
　?。?）通過微陣列分析研究AGC lncRNA和mRNA表達譜，通過數(shù)據(jù)庫分析超過33045條lncRNA，發(fā)現(xiàn)當中154 lncRN

9、As經(jīng)過CRS+HIPEC治療后表達上調(diào)超過2倍，412條lncRNAs下調(diào)超過2倍（倍數(shù)變化>2.0，P＜0.05）表明這些lncRNA可能對AGC的治療具有重要影響。
　?。?）通過GENCODE annotation我們證實了lncRNA的類增強子功能。8條類增強子lncRNA的表達譜在CRS+HIPEC治療后出現(xiàn)顯著差異表達(fold change>2.0, P＜0.05)。
　?。?）通過對熱灌注化療前、后 mRN

10、A調(diào)控通路分析，我們分別鑒定出10條上調(diào)通路及10條下調(diào)通路，其中包括鈣離子通路、GnRH的通路、Toll樣受體通路、p53通路、緊密連接和類固醇激素代謝通路等。
　?。?）通過實時定量 PCR驗證我們篩選出來的8條 lncRNA（包括BC031243,RP11356I2.2,CR605611,CEACAMP10,lincRNA-MCTP2-2,lincRNA-AKR1 C3-2, RP11-128M1.1, and RP1190

11、9N17.3）的表達，發(fā)現(xiàn)基因芯片結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。對6組治療后的血清樣本分析發(fā)現(xiàn)BC031243和RP11-356I2.2差異表達最顯著（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　我們的研究通過對比分析AGC行CRS+HIPEC治療前、后樣品中l(wèi)ncRNA的差異性表達譜，篩選出差異性表達的lncRNA，通過 GO注釋分別從生物學功能、參與的生物途徑以及細胞中的定位對這些 lncRNA的功能進一步分析。通過 Pathway