Bach1在紫檀芪防御 UV致 HaCaT細(xì)胞急性光損傷中的作用.pdf

1、【研究背景】
　　皮膚是被覆于體表的人體最大的器官，保護(hù)人體避免遭受各種環(huán)境因素尤其是紫外線（ultraviolet，UV）照射等造成的損傷。UV根據(jù)波長可分為長波紫外線（ultraviolet A，UVA，320﹣400nm）、中波紫外線（ultraviolet B，UVB，280﹣320nm）及短波紫外線（ultraviolet C，UVC，200﹣280nm）三類，作用于人體表面的主要是UVA和UVB。長期或者大量UV輻射可

2、以造成皮膚損傷，如急性日曬傷、慢性光化性皮炎、光老化及皮膚癌等。隨著環(huán)境污染的不斷加重，UV所致皮膚疾病日益嚴(yán)重。目前研究認(rèn)為，UV導(dǎo)致皮膚光損傷的機(jī)制復(fù)雜，除引起DNA雙鏈的破壞和產(chǎn)生嘧啶光產(chǎn)物等直接損傷外，更重要的是氧化應(yīng)激導(dǎo)致過量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）堆積，從而對(duì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等造成損傷，誘發(fā)多種光線性皮膚病。如何清除過量的ROS、增強(qiáng)抗氧化酶活性、闡明皮膚氧化應(yīng)激防御機(jī)制

3、以及尋找科學(xué)有效的UV防護(hù)劑成為目前的研究熱點(diǎn)。
　　核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor erythroid2-relatedfactor2，Nrf2）信號(hào)通路是目前最重要的抗氧化應(yīng)激通路之一。當(dāng)過量的ROS產(chǎn)生時(shí)，Nrf2與Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1（kelch-like-Ech-associated﹣protein1，Keap1）解偶聯(lián)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，原本和Maf識(shí)別元件（Maf recognition el

4、ements，MAREs）結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子BTB-CNC異體同源體-1（BTB CNC homology1,Bach1）解偶聯(lián)，胞核內(nèi)Bach1轉(zhuǎn)位至胞漿內(nèi)，Nrf2和MAREs形成異二聚體后識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE），調(diào)控下游II相解毒酶和抗氧化蛋白的表達(dá)，發(fā)揮其抗氧化作用。Bach1之前被認(rèn)為只是同Nrf2競爭ARE的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)抗氧化基因的表達(dá)起到負(fù)性調(diào)控作用。最近研

5、究發(fā)現(xiàn)Bach1可直接調(diào)控氧化還原、細(xì)胞周期等相關(guān)靶基因的表達(dá)，從而在氧化應(yīng)激反應(yīng)以及多種疾病發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可能成為氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的新型治療靶點(diǎn)。
　　國內(nèi)外研究表明，多種天然植物成分如紫檀芪、茶多酚、姜黃素、枸杞多糖、萊菔硫烷、白藜蘆醇等具有抗氧化作用，其中紫檀芪在多種腫瘤細(xì)胞中可通過調(diào)節(jié)Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用。但紫檀芪對(duì)UV輻照所致皮膚急性光損失是否具有保護(hù)作用以及可能的調(diào)控機(jī)制，目前尚不清楚。因此，本研

6、究擬探討紫檀芪對(duì)UV致人永生化角質(zhì)細(xì)胞（Human keratinocytes，HaCaT）急性光損傷中的防護(hù)作用和Bach1的調(diào)控作用，為新型光防護(hù)劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　【目的】
　　1.探討紫檀芪對(duì)UVA/UVB致HaCaT細(xì)胞急性光損傷是否有防護(hù)作用；
　　2.探討紫檀芪對(duì)UVA/UVB致HaCaT細(xì)胞急性光損傷可能防護(hù)機(jī)制；
　　3.探討B(tài)ach1在紫檀芪防御UVA/UVB致HaCaT細(xì)胞急性光損傷

7、中的機(jī)制。
　　【方法】
　　1.分別以UVA（30 J/cm2）和UVB（300 mJ/cm2）劑量照射HaCaT細(xì)胞，采用MTT法檢測和倒置顯微鏡觀察照射后的細(xì)胞活性及細(xì)胞形態(tài)，以制備HaCaT細(xì)胞急性光損傷模型；
　　2.CCK﹣8法和倒置顯微鏡觀察篩選紫檀芪非細(xì)胞毒性作用濃度；
　　3.用MTT法和彗星實(shí)驗(yàn)檢測紫檀芪對(duì)UVA/UVB照射HaCaT細(xì)胞前后的細(xì)胞活性和DNA損傷情況；
　　4.用WST

8、-1法和DCFH-DA法檢測紫檀芪對(duì)UVA/UVB照射HaCaT細(xì)胞前后SOD活性和ROS水平的變化；
　　5.用Western Blot法檢測紫檀芪對(duì)Nrf2/Bach1蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布；
　　6.用Western Blot檢測磷酸激酶抑制劑Genistein對(duì)Nrf2/Bach1蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布；
　　7.用CCK-8法檢測磷酸激酶抑制劑Genistein對(duì)UVA/UVB照射紫檀芪孵育HaC

9、aT細(xì)胞前后的細(xì)胞活性變化；
　　8.構(gòu)建過表達(dá)的干擾短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）的慢病毒載體的克隆，將HaCaT細(xì)胞中Nrf2敲低，獲得Nrf2KD細(xì)胞；
　　9.采用qRT-PCR技術(shù)分析HaCaT細(xì)胞和Nrf2KD細(xì)胞中Bach1可能調(diào)控的相關(guān)靶基因。
　　【結(jié)果】
　　1.分別以30 J/cm2的UVA和300 mJ/cm2的UVB劑量照射HaCaT細(xì)胞后其細(xì)胞活性下降（

10、P＜0.05），細(xì)胞形態(tài)變圓，體積增大，胞內(nèi)顆粒增加。
　　2.用CCK-8法和倒置顯微鏡篩選出紫檀芪的非細(xì)胞毒性作用濃度5μM。
　　3.用MTT法檢測紫檀芪對(duì)UVA/UVB照射HaCaT細(xì)胞前后的細(xì)胞活性，與對(duì)照相比較，UVA/UVB照射后細(xì)胞活性下降（P＜0.05）；紫檀芪預(yù)處理后細(xì)胞活性上升（P＜0.05）。用彗星實(shí)驗(yàn)檢測紫檀芪對(duì)UVA/UVB照射HaCaT細(xì)胞前后DNA損傷，與對(duì)照相比較，細(xì)胞核的尾長、尾矩、尾部D

11、NA含量、尾部DNA百分比均顯著增加（P＜0.05）；紫檀芪預(yù)處理后細(xì)胞核的尾長、尾矩、尾部DNA含量、尾部DNA百分比均減少（P＜0.05）。
　　4.用WST-1法檢測紫檀芪對(duì)UVA/UVB照射HaCaT細(xì)胞前后SOD活性，與對(duì)照組比較，SOD活性上升（P＜0.05），紫檀芪處理后SOD活性上升（P＜0.05）；用DCFH-DA法檢測紫檀芪孵育后HaCaT細(xì)胞ROS水平，與對(duì)照相比較，ROS水平上升（P＜0.05），紫檀芪預(yù)處

12、理后ROS水平下降（P＜0.05）。
　　5.用Western Blot法檢測紫檀芪對(duì)Nrf2/Bach1蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布，胞核內(nèi)Nrf2增加，Bach1減少。
　　6.用Western Blot法檢測磷酸酶抑制劑Genistein處理紫檀芪孵育HaCaT細(xì)胞，胞核內(nèi)Bach1增加，Nrf2無變化。
　　7.用CCK-8法檢測磷酸激酶抑制劑Genistein對(duì)UVA/UVB照射紫檀芪孵育HaCaT細(xì)胞活性的

13、變化，與對(duì)照組比較，磷酸酶抑制劑Genistein對(duì)HaCaT細(xì)胞的活性無影響（P＞0.05），磷酸酶抑制劑Genistein對(duì)UVA/UVB照射紫檀芪孵育HaCaT細(xì)胞的活性下降（P＜0.05）。
　　8.采用慢病毒將Nrf2-shRNA轉(zhuǎn)染至HaCaT細(xì)胞中，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中Nrf2蛋白抑制率>80％。
　　9.采用qRT-PCR技術(shù)分析HaCaT細(xì)胞，與未加磷酸酶抑制劑Genistein對(duì)照相比較，bach1、bcl2l11

14、、ftl、hmga2、hmox1、mafg、mapt、mmp13、mmp9、sqstm1、tfe3、vrna1-1和vrna1-2基因的表達(dá)上升（P＜0.05）；采用qRT-PCR技術(shù)分析Nrf2KD細(xì)胞，與未加磷酸酶抑制劑Genistein對(duì)照相比較，gclc、gclm、hmga2、hmox1、itpr2、me1和vrna1-2基因的表達(dá)下降（P＜0.05），mafg、mapt和vegf基因的表達(dá)上升（P＜0.05）。
　　【結(jié)

15、論】
　　1.紫檀芪對(duì)UVA/UVB致HaCaT細(xì)胞的急性光損傷具有防護(hù)作用；
　　2.紫檀芪對(duì)UVA/UVB致HaCaT細(xì)胞急性光損的防護(hù)作用機(jī)制可能是激活抗氧化信號(hào)通路、提高細(xì)胞活性、降低DNA損傷；
　　3.Bach1在紫檀芪防御UVA/UVB致HaCaT細(xì)胞急性光損傷中起調(diào)控作用，其可能是通過與Nrf2協(xié)同上調(diào)gclc、gclm、hmga2、hmox1、itpr2、me1和vrna1-2基因的表達(dá)，同時(shí)單獨(dú)上調(diào)