基于血漿游離DNA高通量測序的原發(fā)性肝細胞癌的分子分型及其對肝癌TACE術(shù)后殘癌或復(fù)發(fā)的早期預(yù)警.pdf

1、研究背景：
　　外科切除、肝移植術(shù)和局部消融是肝細胞癌（hepatocelluar carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌）可能治愈的方法。對于晚期或進展期肝癌患者，臨床以非手術(shù)治療為主。經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)（Transcatheter arterial chemoem-bolization， TACE）以微創(chuàng)、明確的療效已成為臨床非手術(shù)方案首選的治療方法。TACE術(shù)后殘癌及復(fù)發(fā)是影響肝癌遠期療效的瓶頸。因此，肝癌的早期篩查、診斷

2、和治療對于改善患者預(yù)后有重要的意義。特別是如何早期明確診斷 TACE術(shù)后殘癌及復(fù)發(fā)，是當(dāng)今面臨的嚴(yán)峻問題。目前針對殘癌的診斷及隨訪主要依靠血清學(xué)檢測和影像學(xué)檢查，其中以影像學(xué)檢查為主。血清學(xué)檢測最常見的是AFP檢測。但臨床證實AFP特異性、敏感性差，并且在不同的疾病進展?fàn)顟B(tài)下，AFP的高低并不能實時反應(yīng)出腫瘤進展的真實情況。影像學(xué)檢查對于位置深的小病灶或者低流速、乏血供病灶的診斷精確性較差。近年來研究表明，血漿游離DNA（cell fr

3、ee DNA，cfDNA）能有效反映患者整體的腫瘤負荷、惡性程度、轉(zhuǎn)移能力以及實時的基因突變信息，與腫瘤組織的基因信息呈一定相關(guān)性。通過對血漿cfDNA測序檢測腫瘤相關(guān)的基因拷貝數(shù)變化、甲基化變化、染色體重排變化等已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、用藥指導(dǎo)和檢測腫瘤發(fā)生情況。文獻報告，cfDNA的變異情況對腫瘤患者的輔助診斷價值優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物，如CEA、CA199等，某些方面也優(yōu)于影像學(xué)檢查。但極少有相關(guān)的臨床研究。
　　目前關(guān)于肝癌的治

4、療，主要依據(jù)是病理類型及肝癌分級。但臨床發(fā)現(xiàn)，同一病理類型的肝癌，經(jīng)過相同的治療方案，其結(jié)果卻差別很大。提示肝癌分子分型不同。依據(jù)分子分型進行個體化的精準(zhǔn)治療，是肝癌研究的熱點，也是趨勢。
　　因此，本研究旨在通過前瞻性研究，探索基于cfDNA的肝癌分子分型及其對肝癌TACE后殘癌的早期預(yù)警。
　　研究目的：
　　評估基于第二代測序技術(shù)的cfDNA腫瘤相關(guān)基因變異檢測是否可以用于分析肝癌的分子分型；觀察肝癌患者在介入治

5、療過程中血漿cfDNA動態(tài)變異的出現(xiàn)，是否早于傳統(tǒng)的實驗室和影像學(xué)檢查，并實時、客觀反應(yīng)腫瘤進展。
　　材料和方法：
　　本研究分為兩個部分，第一部分，利用基于第二代測序技術(shù)的目標(biāo)基因靶向測序技術(shù)，對41例肝癌患者的腫瘤組織DNA、血漿cfDNA和血細胞DNA中的21個腫瘤相關(guān)基因進行捕獲測序。分析腫瘤組織DNA、血漿cfDNA和血細胞基因組DNA中的腫瘤相關(guān)突變基因及突變負荷率，比對出差異基因，以及差異基因的突變趨勢。

6、r>　　第二部分選擇接受TACE治療的肝癌患者（包括早期和中晚期），定期檢測和評估患者血漿cfDNA基因變異的情況，同時從臨床癥狀、影像學(xué)檢查、實驗室檢查（AFP）等方面進行隨訪，判斷患者血漿 cfDNA動態(tài)變異的出現(xiàn)，是否早于傳統(tǒng)的實驗室和影像學(xué)檢查，并實時反應(yīng)腫瘤進展情況。
　　結(jié)果：
　　本研究的第一部分，在肝癌患者中驅(qū)動基因（PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53、ERBB4）的變異負荷率最大。在高頻變異的基因

7、中，血細胞DNA總體變異譜（基于變異頻率）不同于腫瘤組織DNA和血漿游離DNA變異譜，而腫瘤組織DNA和血漿cfDNA變異譜較為接近，提示血漿cfDNA和腫瘤組織DNA中腫瘤相關(guān)基因變異的一致性較好。多發(fā)病灶的肝癌患者血漿游離 DNA中CTNNB1、PIK3CA、MET、EGFR、FBXMW7、EGFR、TP53、ERBB2基因變異負荷量較單發(fā)病灶患者高。AFP正常的患者中血漿cfDNA基因變異結(jié)果顯示，在AFP正常的肝癌患者（AFP<

8、20ng/ml）中CTNNB1、EGFR、ALK、BRAF、NOTCH1基因變異負荷量較高。
　　本研究的第二部分，在前期基礎(chǔ)研究納入的患者中，選取其中資料完善、隨訪規(guī)律的三例患者為觀察對象，前瞻性的觀察患者在介入治療期間cfDNA動態(tài)變異情況。兩例患者均為晚期肝癌，病灶為巨塊型，伴多發(fā)小結(jié)節(jié)，門脈受侵犯伴有癌栓，均接受了3次TACE治療。1例為早期肝癌患者。治療前和治療后一周期間，患者血漿 cfDNA中腫瘤驅(qū)動基因（NRAS、B

9、RAF、PIK3CA、ARID1A、AXIN1、ARID2、TERT、TP53、CTNNB1基因）的變異負荷量未發(fā)生變化，而此期間 AFP是下降趨勢，影像學(xué)評估為疾病緩解（PR）。治療后1個月時，患者血漿cfDNA中腫瘤驅(qū)動基因的變異負荷量總體呈現(xiàn)上升趨勢，提示腫瘤進展，但此時AFP仍然下降，患者影像學(xué)評估仍為疾病緩解?；颊咧委熀?個半月后時，AFP又明顯升高，影像學(xué)此時評估為病變進展（PD）。另一例早期肝癌患者，cfDNA的變異負荷量

10、的變化，也客觀反映了腫瘤進展情況，早于影像學(xué)，并且在后期的治療中得到了臨床驗證。
　　結(jié)論：
　　1.肝癌患者血漿cfDNA和腫瘤組織DNA中腫瘤相關(guān)基因變異的一致性較好。
　　2.多發(fā)病灶的肝癌患者血漿游離DNA中CTNNB1、PIK3CA、MET、EGFR、FBXMW7、TP53、ERBB2基因變異負荷量較單發(fā)病灶患者高。
　　3.在AFP正常的肝癌患者（AFP<20ng/ml）中 CTNNB1、EGFR、A