竹黃的分離鑒定與竹紅菌素光動力誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制.pdf

1、竹黃（Shiraia bambusicola）為一種特異性寄生在某些種類竹子上的真菌，其子座是我國民間一種重要的中藥材。竹紅菌素是竹黃主要活性成分之一，是一類由我國學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)的、從竹黃子座中提取得到的天然苝醌類色素。近年來，隨著對竹紅菌素抗癌等藥理活性研究的不斷深入，竹黃顯示出巨大的開發(fā)前景，越來受到研究者們的重視。
　　目前，竹黃和竹紅菌素的來源仍然是野生竹黃資源，而野生自然資源有限，受分布地域、季節(jié)及寄主等多種因子的嚴(yán)格限制

2、。為了給將來人工條件下的竹紅菌素生產(chǎn)提供菌種資源，分離篩選出適合生產(chǎn)竹紅菌素的菌株十分必要。本研究采用PDA等多種菌種分離培養(yǎng)基、使用組織分離法結(jié)合苝醌類顏色反應(yīng)，從竹黃子實體分離得到一株產(chǎn)苝醌類色素的菌株，命名為S-4201。利用制備型反相高效液相色譜法對色素粗提物進(jìn)行分離，與從子實體中提取得到的竹紅菌素標(biāo)準(zhǔn)品比對，證實菌株S-4201所產(chǎn)色素的主要成分是竹紅菌甲素（Hypocrellin A，HA）。使用通用引物ITS5/ITS4進(jìn)

3、行PCR擴(kuò)增得到的ITS rDNA全長為533bp，對共13個序列進(jìn)行比對，比對后的位點(diǎn)數(shù)為508bp，其中變異位點(diǎn)143個(28.15％)，保守位點(diǎn)365個(71.85％)。rDNA的聚類分析結(jié)果證明，S-4201菌株與GenBank中的竹黃（Shiraia bambusicola）親緣關(guān)系很近，綜合該菌株能夠產(chǎn)竹紅菌素這一生理特征，以及菌落和顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)，將其列為竹黃屬（Shiraia）。
　　光動力療法(Photodynam

4、ic therapy，PDT)是全身或局部施用光敏劑、并使用一定波長的可見光源照射，來清除癌細(xì)胞或非癌細(xì)胞的治療方法。目前，研究者對于竹紅菌素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方式仍存在著爭議，為了竹紅菌素在抗癌藥物領(lǐng)域的開發(fā)和利用，我們又在分子水平上對其抗癌機(jī)制進(jìn)一步了深入研究。本文使用從子實體中提取獲得的HA，對其介導(dǎo)的光動力處理對人肺腺癌細(xì)胞A549的毒性和誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡進(jìn)行了評價，并使用了同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)2D-LC-MS/

5、MS的時間定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法來輔助研究細(xì)胞毒性的分子機(jī)制，以探索HA光動力誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的潛在作用位點(diǎn)。Caspase抑制劑被用來進(jìn)一步闡明在PDT處理后A549細(xì)胞的凋亡分子通路。最后，對下游的凋亡相關(guān)蛋白也進(jìn)行了評估。本研究通過發(fā)現(xiàn)細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻、DNA片段化、線粒體結(jié)構(gòu)和功能的破壞，證明HA光動力誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，且該過程由細(xì)胞內(nèi)升高的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)水平引發(fā)。將

6、從PDT處理后的細(xì)胞中收集到的蛋白與未處理組相比，鑒定發(fā)現(xiàn)了與凋亡通路相關(guān)的五個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，廣泛caspase抑制劑和caspase-9抑制劑能顯著抑制凋亡。線粒體破壞、細(xì)胞色素C的釋放和caspase-3，-9，-7激活說明線粒體在HA光動力誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色。
　　竹紅菌素的水溶性差，靜脈注射進(jìn)入血液后容易造成聚集，會使正常給藥過程復(fù)雜化，影響藥物的生物分布，使光動力療法的效率下降。竹

7、紅菌素的低水溶性將限制它在臨床PDT中的應(yīng)用，而化學(xué)修飾的竹紅菌素往往暗毒性較高或者單線態(tài)氧產(chǎn)率低，因此使用合適的制劑技術(shù)來改善竹紅菌素水溶性成為了研究熱點(diǎn)。本研究中以水包油(O/W)乳液溶劑蒸發(fā)法，將HA包封入聚乳酸羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)制備獲得了粒徑在20～200nm之間、表面電荷為-5.8mV的水分散納米顆粒。通過X射線衍射光譜、紅外光譜分析和差示熱分析，印證了HA被成功的