環(huán)磷酰胺在移植治療再生障礙性貧血中的應(yīng)用及對(duì)造血功能的影響.pdf

1、研究背景及目的:
　　背景再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一組由理化因素、生物因素及不明原因引起的骨髓造血衰竭性疾病，具有致死率高、預(yù)后差等特點(diǎn)，造血干細(xì)胞移植成為根治 AA的最有效方法。然而由于計(jì)劃生育政策，同胞兄妹供者較少，對(duì)于單倍型造血干細(xì)胞移植來(lái)說(shuō)，患者父母及兄弟姐妹均可作為其供者來(lái)源，使得單倍型造血干細(xì)胞移植成為主流力量。但嚴(yán)重的移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，

2、GVHD）和移植物排斥反應(yīng)的發(fā)生成為主要障礙，直接影響移植后的長(zhǎng)期生存率。環(huán)磷酰胺（CTX）具有強(qiáng)效的免疫抑制抗腫瘤作用，移植后高劑量 CTX誘導(dǎo)免疫耐受在單倍型移植中的應(yīng)用引起關(guān)注，但是應(yīng)用時(shí)機(jī)和劑量很重要。CTX誘導(dǎo)耐受新方法在單倍型移植中占有重要作用，但對(duì)于 CTX誘導(dǎo)免疫耐受的作用機(jī)制及特點(diǎn)目前尚未完全清楚，特別擔(dān)心對(duì)造血重建的影響，本研究通過(guò)小鼠實(shí)體實(shí)驗(yàn)觀察CTX對(duì)造血干細(xì)胞的影響，為移植工作提供理論依據(jù)。
　　目的:1

3、.評(píng)價(jià)單倍型移植后應(yīng)用高劑量 CTX誘導(dǎo)免疫耐受治療重型再生障礙性貧血（SAA）的臨床療效；2.通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量CTX對(duì)小鼠造血功能的影響。
　　研究方法:
　　1.2014年1月至2015年8月期間單中心中國(guó)人民解放軍陸軍總醫(yī)院血液科移植后使用高劑量CTX誘導(dǎo)免疫耐受單倍型造血干細(xì)胞移植新方法治療的16例SAA患者，男7例，女9例，患者中位年齡14.5（4～30）歲。所有均為親緣單倍型供者，其中父親供者9例，母親供

4、者5例，同胞兄妹供者2例，供者中位年齡31（20～45）歲。觀察全部患者移植后植入情況、造血重建（包括中性粒細(xì)胞及血小板植活時(shí)間）、移植相關(guān)并發(fā)癥（移植物抗宿主病、感染及出血）、存活情況及隨訪時(shí)間等指標(biāo)。
　　2．選取雌性純系 BALB/c小鼠，按照常規(guī)方法制成再生障礙性貧血小鼠模型，所有造模成功后的小鼠隨機(jī)分組以供實(shí)驗(yàn)需要。將環(huán)磷酰胺藥物以無(wú)菌生理鹽水溶解，按CTX處理劑量（380mg/kg、200mg/kg、100mg/kg）

5、作用于實(shí)驗(yàn)組小鼠，動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)組（HD-CTX組、MD-CTX組、LD-CTX組）、AA模型對(duì)照組、正常對(duì)照組小鼠一般狀況、外周血血常規(guī)變化、雙側(cè)股骨有核細(xì)胞數(shù)（NC）及股骨骨髓病理切片、半固體甲基纖維素培養(yǎng)法測(cè)定紅系集落形成單位（BFU-E）、粒單系集落形成單位（CFU-GM）及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血及骨髓CD34+細(xì)胞變化。
　　結(jié)果:
　　1．全部16例患者除1例原發(fā)排斥，余15例完全植入，其中有2例患者第1次未植入，行

6、二次移植達(dá)到完全供者植入狀態(tài)。粒細(xì)胞植活中位時(shí)間15.5（14～26）天、血小板植活中位時(shí)間22.0（17～32）天。隨訪至2016年8月，中位隨訪時(shí)間17.4（9～28）月，存活患者隨訪時(shí)間均在6個(gè)月以上，最長(zhǎng)隨訪時(shí)間達(dá)28個(gè)月。移植后共有8例發(fā)生急性GVHD，其中IV度急性GVHD2例，III度急性GVHD3例，I～I(xiàn)I度急性GVHD3例，按部位分為腸道3例、肝臟3例、皮膚2例；2例發(fā)生慢性GVHD，均發(fā)生在皮膚。肺部感染7例；巨細(xì)

7、胞病毒感染3例，其中2例發(fā)展為巨細(xì)胞肺炎，予更昔洛韋、磷甲酸鈉治療后好轉(zhuǎn)，無(wú)肝靜脈綜合征及移植后淋巴細(xì)胞增殖發(fā)生；出血性膀胱炎4例。所有患者1例因未植入死亡，1例因嚴(yán)重肺部感染死亡，1例因急性GVHD死亡，其余13例仍存活。
　　2.1）全部受鼠基于AA再障發(fā)病機(jī)制建造AA小鼠模型成功。2）正常對(duì)照組白細(xì)胞及血小板數(shù)目波動(dòng)在正常范圍；AA模型組白細(xì)胞及血小板變化大致相似，均進(jìn)行性下降，第5天開(kāi)始明顯下降，分別為（0.46±0.32

8、）×109/L、（33.4±14.67）×109/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LD-CTX及MD-CTX組白細(xì)胞數(shù)目在第9天開(kāi)始回升。HD-CTX組白細(xì)胞數(shù)目變化與模型組大致相同。AA模型組骨髓及外周血CD34+細(xì)胞進(jìn)行性下降，第5天降至較低水平，（1.76±0.28）×109/L，第7天開(kāi)始回升，但仍低于正常，為（2.86±0.45）×109/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LD-CTX及MD-CTX組第3天骨髓及外

9、周血CD34+細(xì)胞降至最低，分別（0.66±0.30）×109/L、（0.72±0.40）×109/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），第7天細(xì)胞數(shù)開(kāi)始回升。HD-CTX組骨髓及外周血CD34+細(xì)胞第3天最低，為（0.49±0.38）×109/L，隨后一直處于低水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型AA組CFU-GM、CFU-E集落形成數(shù)明顯減少，48h、96h分別形成的CFU-GM、CFU-E集落數(shù)為（10.00±5.00）個(gè)

10、、（5.00±3.00）個(gè)、（12.67±3.79）個(gè)、（5.33±3.21）個(gè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LD-CTX、MD-CTX、HD-CTX組與模型組比較無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.移植后高劑量 CTX誘導(dǎo)免疫耐受單倍型異基因造血干細(xì)胞移植治療重型再生障礙性貧血，造血重建穩(wěn)定，有較好的臨床療效。
　　2.單倍型造血干細(xì)胞移植后應(yīng)用高劑量 CTX誘導(dǎo)免疫耐受可減少移植相關(guān)并發(fā)癥，是預(yù)防單倍型移植G

11、VHD發(fā)生的新方法。
　　3.將受鼠 BALB/C小鼠經(jīng) Co60γ放射線亞致死量（5.5Gy）全身照射，將 DBA/2小鼠的淋巴細(xì)胞懸液在4小時(shí)內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸注受鼠（BALB/C鼠）體內(nèi)，該過(guò)程大致模擬AA發(fā)病過(guò)程，制造AA小鼠模型，觀察AA小鼠外周血血常規(guī)變化、骨髓有核細(xì)胞數(shù)及骨髓病理變化均符合AA的病理變化，說(shuō)明小鼠AA造模成功。
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)CTX對(duì)骨髓造血功能無(wú)明顯損傷作用，為臨床移植工作應(yīng)用高劑量CTX誘導(dǎo)