SHARPIN參與皮膚基底細(xì)胞癌發(fā)病的功能學(xué)研究.pdf

1、近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SHARPIN參與肝癌、腎癌、骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展，提示SHARPIN是一個新的腫瘤相關(guān)基因。SHARPIN表達(dá)于多種組織和器官，參與調(diào)控NF-κB、JNK信號通路、角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡等，具有調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞增殖與凋亡等多種生物學(xué)功能。目前尚無SHARPIN與皮膚腫瘤發(fā)病關(guān)系的研究。皮膚基底細(xì)胞癌(Basal cell carcinoma，BCC)是人類最常見的皮膚腫瘤，其發(fā)病與Hedgehog信號通路

2、有很大關(guān)聯(lián)，Hedgehog信號通路下游分子GLI1和GLI2可以直接調(diào)控c-JUN，有研究證實(shí)c-JUN在BCC組織中高表達(dá)，JUN是JNK信號通路下游信號分子。因此我們提出疑問，SHARPIN是否通過調(diào)控經(jīng)典的JNK信號通路參與BCC的發(fā)生發(fā)展？本課題擬研究SHARPIN在BCC中所起的功能及其相關(guān)的信號通路。
　　研究目的：
　　1.明確SHARPIN基因在BCC中的突變情況;
　　2.明確SHARPIN蛋白在B

3、CC組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況;
　　3.研究SHARPIN表達(dá)變化對BCC細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響;
　　4.研究SHARPIN表達(dá)變化通過哪些信號通路和分子影響B(tài)CC細(xì)胞功能。
　　研究內(nèi)容和方法：
　　1.SHARPIN基因突變及表達(dá)變化與BCC的相關(guān)性研究
　　1)SHARPIN基因在BCC石蠟組織中的突變情況
　　采用PCR對SHARPIN外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，Sanger測序后分析SHAR

4、PIN基因的突變情況。
　　2)SHARPIN蛋白在BCC組織中的表達(dá)情況
　　采用免疫組化技術(shù)，檢測SHARPIN蛋白在BCC和正常皮膚中的表達(dá)情況;采用Western Blot檢測BCC細(xì)胞株TE354.T和人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT中SHARPIN蛋白表達(dá)差異;采用免疫熒光檢測SHARPIN在BCC組織中的定位。
　　2.SHARPIN對BCC細(xì)胞株TE354.T細(xì)胞功能的影響
　　1)構(gòu)建SHARPI

5、N過表達(dá)和沉默慢病毒載體，轉(zhuǎn)染TE354.T細(xì)胞，采用WB和qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率;
　　2)利用EdU、CCK-8檢測SHARPIN表達(dá)變化對細(xì)胞增殖的影響;
　　3)利用TUNEL和AnnexinⅤ檢測SHARPIN表達(dá)變化對細(xì)胞凋亡的影響;
　　4)利用Transwell檢測SHARPIN表達(dá)變化對細(xì)胞侵襲和遷移的影響。
　　3.SHARPIN表達(dá)變化影響細(xì)胞功能的分子機(jī)制研究
　　1)根據(jù)第2部

6、分結(jié)果利用WB檢測SHARPIN表達(dá)變化對細(xì)胞功能相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;
　　2)利用WB檢測SHARPIN表達(dá)變化對JUN和GLI蛋白表達(dá)的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.BCC中SHARPIN基因存在高頻突變，突變率達(dá)28.1％; SHARPIN蛋白在BCC癌組織中表達(dá)降低或喪失;
　　2.SHARPIN低表達(dá)可以促進(jìn)TE354.T細(xì)胞的增殖;
　　3.SHARPIN低表達(dá)使Cyclin D1和CDK4表

7、達(dá)升高;c-JUN表達(dá)降低，磷酸化c-JUN表達(dá)升高;GLI1表達(dá)無明顯變化，GLI2表達(dá)升高。
　　研究結(jié)論：
　　1.SHARPIN在BCC組織中表達(dá)顯著降低甚至喪失，且存在高頻突變，提示SHARPIN在BCC發(fā)病中具有腫瘤抑制基因的特征，可作為基底細(xì)胞癌鑒別診斷的分子標(biāo)記;
　　2.SHARPIN低表達(dá)可以促進(jìn)TE354.T細(xì)胞的增殖，提示SHARPIN表達(dá)下降加快細(xì)胞增殖可能是調(diào)控BCC發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制;