miR-200c靶向調(diào)控FUT4調(diào)節(jié)子宮接受態(tài)的建立.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景與目的:
  1.蛋白質巖藻糖基化在子宮內(nèi)膜對胚胎的接受能力方面發(fā)揮重要作用。
  2.巖藻糖基轉移酶Ⅳ(FUT4)在哺乳動物子宮內(nèi)膜上皮細胞中呈階段特異性表達,因此被作為評價子宮內(nèi)膜接受態(tài)的一個重要指標。
  3. microRNAs是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA,miR-200c是miR-200家族的成員之一,在人類生殖過程中發(fā)揮作用。但是,miR-200c與FUT4的關系以及其在子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立過程中的作

2、用未見報道。
  4.本研究旨在探討miR-200c對子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立、胚胎著床的影響及其作用機制,闡述miR-200c對哺乳動物胚胎著床過程的調(diào)控作用。
  方法:
  1.通過Real-time PCR,Western blot,ELISA檢測正常未孕、不孕癥、正常早孕、流產(chǎn)患者血清中miR-200c、FUT4的表達。
  2. CCK8、平板克隆形成實驗和細胞體外黏附實驗檢測miR-200c對細胞增殖及

3、接受胚胎能力的影響。
  3.雙熒光素酶基因報告實驗驗證FUT4是否是miR-200c的靶基因。
  4.通過Wnt/β-catenin信號通路進一步研究miR-200c對胚胎著床的調(diào)控作用。
  結果:
  1. PCR、ELISA和Western blot方法檢測結果顯示:不孕癥患者血清中miR-200c的表達比正常未孕女性高,流產(chǎn)患者血清中miR-200c的含量比正常早孕女性血清中高,具有顯著性差異(*p<

4、0.05;***p<0.001)。不孕癥患者血清中FUT4的表達比正常未孕女性低,流產(chǎn)患者血清中FUT4的含量比正常早孕女性血清中低,具有顯著型差異(**p<0.01;***p<0.001)
  2. miR-200c抑制細胞增殖和胚胎黏附功能。CCK-8實驗連續(xù)5天記錄細胞的生長情況。轉染miR-200c mimics細胞組的生長速度顯著慢于對照組細胞,而轉染Anti-miR-200c后,細胞的增殖能力顯著高于對照組。平板克隆形

5、成實驗結果顯示,miR-200c mimics轉染組細胞的克隆形成數(shù)低于對照組,而轉染Anti-mR-200c細胞組細胞的克隆形成數(shù)顯著高于對照組,差異存在統(tǒng)計學意義(**p<0.01;***p<0.001)。細胞體外黏附實驗結果顯示,轉染miR-200c mimics細胞組的黏附能力顯著低于對照組,轉染Anti-miR-200c細胞組的黏附能力顯著高于對照組,差異存在統(tǒng)計學意義(*p<0.05)。
  3. FUT4是miR-2

6、00c的靶基因。通過軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-200c與FUT4存在結合位點,因此我們構建了相應熒光素酶載體,同時構建了相應的突變型載體,與miR-200c mimics共同轉染進入RL-95細胞中。轉染miR-200c mimics與熒光素酶載體的RL95-2細胞中,F(xiàn)UT4的熒光素酶活性低于對照組(*p<0.05);轉染miR-200c mimics與熒光素酶載體的RL95-2細胞中FUT4的熒光素酶活性與轉染突變型載體組FUT4的熒光素

7、酶活性不存在統(tǒng)計學差異。Western blot結果顯示miR-200c mimics轉染后可顯著下調(diào)FUT4的表達,當與FUT4 cDNA共轉染后,又可以回調(diào)FUT4的表達。Anti-miR-200c轉染后可顯著上調(diào)FUT4的表達,當與FUT4 siRNA共轉染后可回調(diào)FUT4的表達。細胞免疫熒光染色得到了相同的結果,miR-200c可下調(diào)FUT4的表達。
  4. miR-200c通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激

8、活影響子宮內(nèi)膜細胞的功能。轉染miR-200c可抑制p-GSK3β、β-catenin的表達,其結果與使用Wnt/β-catenin通路抑制劑DKK的效果一致,當與FUT4 cDNA共轉染后可重新激活p-GSK3β、β-catenin的表達。當Anti-miR-200c抑制miR-200c的表達后可激活p-GSK3β、β-catenin的表達,與FUT4 siRNA共轉染后可重新抑制p-GSK3β、β-catenin的表達。
  

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