聯(lián)用色譜在中藥活性成分和生物樣品分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、近年來(lái)，“回歸自然”的浪潮使中藥備受關(guān)注，中藥現(xiàn)代化的步伐越來(lái)越快。中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中主要面臨著兩方面的問(wèn)題：①中藥成分復(fù)雜，并且成分之間相互影響和作用，同一成分化合物的分析結(jié)果可能會(huì)因母體藥材或制劑配方的改變而受到不同程度的影響。故建立簡(jiǎn)單、可靠的中藥及其復(fù)方中活性成分的分析方法是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的基本前提之一。②中藥的有效成分是新藥開(kāi)發(fā)的先導(dǎo)，但是中藥的藥效成分與生物體內(nèi)的代謝作用機(jī)理還不是十分清晰，因此建立靈敏、準(zhǔn)確、快速生物樣品中中

2、藥活性成分的測(cè)定分析方法，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)中藥藥代動(dòng)力學(xué)的研究就顯得尤為迫切。聯(lián)用色譜技術(shù)的發(fā)展為中藥的質(zhì)量控制研究和中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一個(gè)高效、可靠的分析方法?；诖?，本文主要開(kāi)展了以下幾方面的創(chuàng)新性研究工作： (1)采用分子印跡技術(shù)，以表兒茶素作為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，乙烯基二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，合成了表兒茶素分子印跡聚合物。用紅外光譜和掃描電子顯微鏡表征了所合成的分子印跡聚合物。通過(guò)篩分，粒子尺寸在15和38

3、μm之間的分子印跡聚合物被選為固相萃取吸附劑。結(jié)果表明：分子印跡聚合物對(duì)表兒茶素具有較高的分子識(shí)別能力和選擇性。而空白聚合物卻不具備這樣的特性。在此基礎(chǔ)上，把此分子印跡聚合物固相萃取小柱用于萃取茶葉提取物，分離富集其中的活性成分單體表兒茶素，獲得了滿(mǎn)意的結(jié)果。 (2)我們選取了梔子中的主要生物活性物質(zhì)梔子甙為目標(biāo)分析物，建立了用于分析梔子和梔子中藥制劑清火梔麥片中的梔子甙的高效液相色譜一二極管陣列—質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC—DAD—E

4、SI/MS)分析方法。為了進(jìn)一步更全面的對(duì)梔子中藥制劑清火梔麥片進(jìn)行質(zhì)量控制，針對(duì)現(xiàn)有分析梔子中藥制劑的缺陷，發(fā)展了簡(jiǎn)便、靈敏的高效液相色譜—二極管陣列—質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC—DAD—ESI/MS)方法同時(shí)分析中藥梔子復(fù)方制劑清火梔麥片及其原料藥材中的活性物質(zhì)脫水穿心蓮內(nèi)酯，穿心蓮內(nèi)酯和梔子甙。這三種活性成分主要用來(lái)作為清火梔麥片的質(zhì)量控制的標(biāo)志物。相對(duì)于其他分析方法，此方法提供了更多的定性、定量信息，同時(shí)能更全面的對(duì)中藥復(fù)方制劑進(jìn)行質(zhì)量

5、控制。 (3)針對(duì)現(xiàn)有的流動(dòng)相體系不能對(duì)橘屬中藥中生物堿類(lèi)和黃酮類(lèi)兩種不同色譜保留行為的活性物質(zhì)同時(shí)分析測(cè)定的現(xiàn)狀，且對(duì)生物堿類(lèi)分析的流動(dòng)相不適合于液質(zhì)聯(lián)用分析，我們采用揮發(fā)性全氟羧酸為離子對(duì)添加劑，解決了生物堿類(lèi)物質(zhì)辛氟林的低保留和峰拖尾，并考察了對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)的色譜保留行為的影響，首次成功地建立了橘屬中藥中生物堿類(lèi)和黃酮類(lèi)物質(zhì)同時(shí)分析的高效液相色譜一二極管陣列—質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC—DAD—ESI/MS)分析方法。并且把這種方法

6、應(yīng)用于橘屬中藥青皮、陳皮、枳實(shí)和枳殼的全面質(zhì)量控制中，獲得滿(mǎn)意的結(jié)果。 (4)以中藥人參中的大分子量活性化合物人參皂甙為研究對(duì)象，研究了高錐孔電壓對(duì)其電離效率，檢測(cè)靈敏度的影響。建立了簡(jiǎn)單、靈敏的分析人參皂甙的高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。高錐孔電壓的采用能大大提高檢測(cè)靈敏度，并且得到用于人參皂甙結(jié)構(gòu)鑒定的加合離子和特征碎片離子。分析方法的線(xiàn)性范圍在5-2×105之間，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)超過(guò)0.990，檢測(cè)限達(dá)到pg級(jí)。該方法成功地

7、應(yīng)用于人參以及人參制劑中的人參皂甙的分析檢測(cè)中，為其質(zhì)量控制提供了更為簡(jiǎn)單、有效的檢測(cè)方法。 (5)在本章中，建立了磁性納米粒子—微波萃取的新方法用于中藥中的有效成分的提取。這種新方法基于磁性納米粒子能夠吸收輻射的微波，把磁性納米粒子作為中間媒介吸收微波。以中藥黃芩的有效成分提取為例，磁性納米粒子—微波萃取整個(gè)的萃取過(guò)程只需要40 s的微波輻射時(shí)間。而且，與一般的微波萃取相比，加入磁性納米粒子的萃取效率更高，需要的有機(jī)溶劑更少。

8、得到的提取物用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用分析。本文所建立的方法的回收率在97.6—104.1％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.5％。黃芩苷，黃芩素，漢黃芩素的檢測(cè)限分別為0.05，1.0和2.0 ng/mL。此方法成功地應(yīng)用到了實(shí)際樣品中有效成分地提取分析檢測(cè)。 (6)為了保護(hù)動(dòng)物，減少或取代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，體外評(píng)估化學(xué)藥品對(duì)細(xì)胞的毒性作用對(duì)于開(kāi)發(fā)新藥用于治療各種各樣的癌癥具有十分重要的作用。盡管伊立替康對(duì)白血病、消化道和卵巢腫瘤具有較好的治療

9、作用，而對(duì)乳腺癌治療的報(bào)道很少。本文首次以乳腺癌細(xì)胞MCF—7為模型，體外評(píng)估了伊立替康對(duì)乳腺癌細(xì)胞的毒性后，建立了快速、簡(jiǎn)單的HPLC—ESI/MS測(cè)定細(xì)胞中伊立替康及其代謝產(chǎn)物SN—38的方法，本法采用—80℃甲醇一步沉淀蛋白，線(xiàn)性范圍可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)大于0.9995，且方法特異性高，基質(zhì)效應(yīng)小，具有合適的精密度和靈敏度。該法成功地測(cè)定了伊立替康作用不同時(shí)間下的MCF—7細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，對(duì)抗腫瘤藥物伊立替康的細(xì)胞藥物代

10、謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了初淺地探討。 (7)樣品制備在HPLC的生物樣品分析中是關(guān)鍵性的一步，經(jīng)典的樣品預(yù)處理包括蛋白質(zhì)沉淀和藥物萃取。此方法的缺點(diǎn)是大大增加了勞動(dòng)量和分析時(shí)間，同時(shí)由于分析物在沉積蛋白質(zhì)上的吸附而降低了回收率。直接進(jìn)樣技術(shù)在節(jié)約時(shí)間和勞力方面顯示出了相當(dāng)大的優(yōu)越性。本工作應(yīng)用簡(jiǎn)單、可靠的膠束液相色譜(micellar liquid chromatography，MLC)法直接進(jìn)樣分析了生物樣品中的隱丹參酮和丹參酮ⅡA。隱