血紅素加氧酶-1調節(jié)擬南芥缺鐵和重金屬毒性反應以及缺鐵調控模型的建立.pdf

1、血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO1)是催化血紅素降解產生一氧化碳(CO)、膽綠素及二價鐵離子的關健限速酶。植物中HO1參與光敏色素前體的合成，具有抗氧化及促進側根發(fā)育等功能。鐵是植物必需的營養(yǎng)元素，缺鐵會引起植物葉片黃化，影響作物的產量和品質。先前我們的研究發(fā)現CO能調節(jié)擬南芥缺鐵反應，而HO1降解血紅素產生的CO是植物體內CO的唯一來源。本文旨在研究AtHO1HY1）在調節(jié)擬南芥缺鐵脅迫響應中的作用。三價鐵還原酶

2、(FCR)能將土壤中的Fe3+轉化為Fe2+以利于植物對有效鐵的吸收。擬南芥在缺鐵后，AtHO1在轉錄和翻譯水平上均被誘導。HO1的激活劑Ht能促進根中FCR的活性，而CO的清除劑Hb卻抑制了缺鐵誘導的FCR活性。為了證實以上結果，我們構建了AtHO1過表達和下調表達的轉基因植株。結果表明，AtHO1過表達（35S:HO1）株能緩解植株缺鐵失綠現象，促進鐵吸收相關基因AtFIT1，AtFRO2，AtIRT1的表達，誘導FCR的活性和增加

3、鐵的積累與利用。而在AtHO1下調表達（35S:AntiHO1）轉基因株系及突變體（hy1）中，得到了相反的結果。缺鐵后，與野生型相比，35S:HO1植株中具有較高水平的CO、水溶性鐵及較低水平的血紅素含量。由此推測，AtHO1調節(jié)鐵平衡可能依靠代謝血紅素產生的CO及游離的鐵。一氧化氮(NO)被認為是調節(jié)鐵平衡的有效信號分子。AtHO1和NO在缺鐵調控中的關系在本文中也進行了探討。AtHO1過表達植株在缺鐵時根系會產生比野生型更多的NO

4、，而35S:AntiHO1植株根系中NO含量較少。另一方面，在缺鐵條件下，NO的清除劑cPTIO抑制了AtHO1誘導FCR活性，NO供體（SNP或NONOate）促進了AtHO1突變體hy1中FCR的活性，但HO1的激活劑Ht對hy1中FCR活性沒有影響。這些結果暗示AtHO1調節(jié)鐵平衡依賴于NO。
　　鎘(Cd)是植物的非必需元素，也可以通過鐵的吸收系統進入植物體內，由于其與鐵吸收有競爭關系，因此植株在Cd脅迫下會減少植株對鐵的

5、吸收而表現出缺鐵失綠癥狀。本文研究結果顯示AtHO1能被Cd誘導。進一步對轉基因植株35S:HO1及35S:AntiHO1在Cd脅迫下的研究發(fā)現AtHO1過表達植株對Cd具有較高的耐性。35S:HO1植株在Cd處理下（尤其是200μMCd處理下）地上部分葉綠素含量明顯高于野生型。同時，35S:HO1植株地上部分和地下部分的干重都高于野生型，并且35S:HO1植株葉片中H2O2及TBARS積累量也明顯少于野生型。通過Cd含量測定發(fā)現AtH

6、O1過表達植株地上部分Cd含量較野生型少，Cd從地下往地上的轉運率也低于野生型，但35S:HO1植株根中的Cd含量卻高于野生型。AtHO1在缺鐵的情況下可以促進鐵吸收相關基因（FIT1，IRT1，FRO2）的表達，這些基因也有助于植株對Cd的吸收。為此，我們檢測了這三個基因的表達情況，觀察到AtHO1在Cd脅迫下能誘導FIT1，IRT1，FRO2的表達。35S:HO1植株根中吸收了更多的Cd，但仍表現一定的耐性，因此我們檢測了定位于液泡

7、膜上的金屬螯合基因MTP3的表達，發(fā)現Cd脅迫下，MTP3在AtHO1過表達植株中表達明顯高于野生型，而AtHO1下調表達的植株中MTP3表達低于野生型。為了證實AtHO1具有調節(jié)植物對有毒重金屬的耐性，我們同時研究了擬南芥對汞(Hg)的毒性反應。Hg也是植物非必需元素。高濃度的汞對細胞毒性很強，可造成植物枯萎，甚至死亡。汞對細胞的毒害作用主要是通過誘發(fā)大量活性氧的產生，導致植物氧化傷害。本文研究表明AtHO1過表達也能緩解Hg對植株生

8、長的抑制作用，減少葉片中H2O2產生和TBARS的積累，降低了對Hg產生應激反應的PCS1和RbohD基因的表達。
　　植物對缺鐵的響應是一個復雜的過程。迄今為止，人們發(fā)現了兩個主要的關鍵因子（PYE和FIT1）介導缺鐵反應。為了深入而全面地了解植物響應缺鐵的主要基因及相關調控機制，我們通過生物信息學方法分析了擬南芥中參與PYE和FIT1缺鐵調控途徑中的相關基因，建立了相關的調控模型。通過共表達分析，鑒定到11個和PYE共表達的基

9、因（參與PYE途徑），17個和IRT1共表達的基因（參與FIT1途徑）。其中有15個基因（包括PYE和FIT1）已通過分子遺傳學鑒定參與了缺鐵調節(jié)，而另外15個基因(At2g42750、At5g05250、ORG1、At5g38820、At3g12900、At1g74770、CEL5、At2g39040、At3g12540、At1g73120、At3g61410、MYB10、GSTL1、At3g61930)到目前還沒有相關的報道。我們將

10、這些基因視作為缺鐵響應的候選基因。另外，通過啟動子分析及芯片數據參考，預測到一些順式元件及相應的轉錄因子(如:ERFs，ABFs，GBFs，ARFs，NACs，WRKYs)參與了PYE和FIT1調控途徑。通過對pye和fit突變體缺鐵芯片數據分析，發(fā)現PYE不僅能調控自身途徑中的共表達基因，而且對FIT1途徑中的某些基因也有影響，而FIT1只對與IRT1共表達的部分基因有調節(jié)作用。另外，據已有報道PYE-module中的基因BHLH03

11、9或BHLH101可以和FIT1形成二聚體，從而調控下游基因表達。根據本文的分析結果，我們建立了擬南芥響應缺鐵調控的模型，并推測PYE調控途徑可以通過BHLH039和BHLH039基因與FIT1調控途徑相互聯系，并且PYE調控途徑有可能位于FIT1調控途徑的上游，從而有序地調節(jié)植物的缺鐵反應。
　　microRNA(miRNA)是一種非編碼蛋白質的小分子RNA(smallRNA)，主要通過對靶基因的負調控去影響生物學過程。植物響應

12、外界脅迫的過程中也有眾多microRNA參與。為此，我們對響應缺鐵的microRNAs進行了鑒定和分析。2011年已有學者根據高通量和降解組的數據庫對水稻和擬南芥全基因組中miRNA和靶基因的一一對應關系做了預測和分析?；谶@個結果，我們發(fā)現擬南芥的180個缺鐵響應基因中有15個缺鐵響應基因被預測為16個miRNA家族(miR158a、miR164c、miR1887、miR2111ab、miR3933、miR395ade、miR837-

13、3P、miR837-5P、miR861-5P)的靶基因。通過Poly(T)adaptorRT-PCR方法對這16個miRNA成熟片段在缺鐵0，1，3和5d的表達變化做了檢測，結果發(fā)現，除了miR158a和miR837-5P之外，其他的miRNA在缺鐵條件下表達都明顯上調，但miR861-5P和miR857在缺鐵3d時表達才有變化，這可能是缺鐵引發(fā)的次級反應（如氧化脅迫等）誘導的。因此我們把除miR861-5P和miR857以外的12個m