血紅素加氧酶-1調節(jié)擬南芥缺鐵和重金屬毒性反應以及缺鐵調控模型的建立.pdf

1、血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO1)是催化血紅素降解產生一氧化碳(CO)、膽綠素及二價鐵離子的關健限速酶。植物中HO1參與光敏色素前體的合成，具有抗氧化及促進側根發(fā)育等功能。鐵是植物必需的營養(yǎng)元素，缺鐵會引起植物葉片黃化，影響作物的產量和品質。先前我們的研究發(fā)現(xiàn)CO能調節(jié)擬南芥缺鐵反應，而HO1降解血紅素產生的CO是植物體內CO的唯一來源。本文旨在研究AtHO1HY1）在調節(jié)擬南芥缺鐵脅迫響應中的作用。三價鐵還原酶

2、(FCR)能將土壤中的Fe3+轉化為Fe2+以利于植物對有效鐵的吸收。擬南芥在缺鐵后，AtHO1在轉錄和翻譯水平上均被誘導。HO1的激活劑Ht能促進根中FCR的活性，而CO的清除劑Hb卻抑制了缺鐵誘導的FCR活性。為了證實以上結果，我們構建了AtHO1過表達和下調表達的轉基因植株。結果表明，AtHO1過表達（35S:HO1）株能緩解植株缺鐵失綠現(xiàn)象，促進鐵吸收相關基因AtFIT1，AtFRO2，AtIRT1的表達，誘導FCR的活性和增加

3、鐵的積累與利用。而在AtHO1下調表達（35S:AntiHO1）轉基因株系及突變體（hy1）中，得到了相反的結果。缺鐵后，與野生型相比，35S:HO1植株中具有較高水平的CO、水溶性鐵及較低水平的血紅素含量。由此推測，AtHO1調節(jié)鐵平衡可能依靠代謝血紅素產生的CO及游離的鐵。一氧化氮(NO)被認為是調節(jié)鐵平衡的有效信號分子。AtHO1和NO在缺鐵調控中的關系在本文中也進行了探討。AtHO1過表達植株在缺鐵時根系會產生比野生型更多的NO

4、，而35S:AntiHO1植株根系中NO含量較少。另一方面，在缺鐵條件下，NO的清除劑cPTIO抑制了AtHO1誘導FCR活性，NO供體（SNP或NONOate）促進了AtHO1突變體hy1中FCR的活性，但HO1的激活劑Ht對hy1中FCR活性沒有影響。這些結果暗示AtHO1調節(jié)鐵平衡依賴于NO。
　　鎘(Cd)是植物的非必需元素，也可以通過鐵的吸收系統(tǒng)進入植物體內，由于其與鐵吸收有競爭關系，因此植株在Cd脅迫下會減少植株對鐵的

5、吸收而表現(xiàn)出缺鐵失綠癥狀。本文研究結果顯示AtHO1能被Cd誘導。進一步對轉基因植株35S:HO1及35S:AntiHO1在Cd脅迫下的研究發(fā)現(xiàn)AtHO1過表達植株對Cd具有較高的耐性。35S:HO1植株在Cd處理下（尤其是200μMCd處理下）地上部分葉綠素含量明顯高于野生型。同時，35S:HO1植株地上部分和地下部分的干重都高于野生型，并且35S:HO1植株葉片中H2O2及TBARS積累量也明顯少于野生型。通過Cd含量測定發(fā)現(xiàn)AtH

6、O1過表達植株地上部分Cd含量較野生型少，Cd從地下往地上的轉運率也低于野生型，但35S:HO1植株根中的Cd含量卻高于野生型。AtHO1在缺鐵的情況下可以促進鐵吸收相關基因（FIT1，IRT1，F(xiàn)RO2）的表達，這些基因也有助于植株對Cd的吸收。為此，我們檢測了這三個基因的表達情況，觀察到AtHO1在Cd脅迫下能誘導FIT1，IRT1，F(xiàn)RO2的表達。35S:HO1植株根中吸收了更多的Cd，但仍表現(xiàn)一定的耐性，因此我們檢測了定位于液泡

7、膜上的金屬螯合基因MTP3的表達，發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下，MTP3在AtHO1過表達植株中表達明顯高于野生型，而AtHO1下調表達的植株中MTP3表達低于野生型。為了證實AtHO1具有調節(jié)植物對有毒重金屬的耐性，我們同時研究了擬南芥對汞(Hg)的毒性反應。Hg也是植物非必需元素。高濃度的汞對細胞毒性很強，可造成植物枯萎，甚至死亡。汞對細胞的毒害作用主要是通過誘發(fā)大量活性氧的產生，導致植物氧化傷害。本文研究表明AtHO1過表達也能緩解Hg對植株生

8、長的抑制作用，減少葉片中H2O2產生和TBARS的積累，降低了對Hg產生應激反應的PCS1和RbohD基因的表達。
　　植物對缺鐵的響應是一個復雜的過程。迄今為止，人們發(fā)現(xiàn)了兩個主要的關鍵因子（PYE和FIT1）介導缺鐵反應。為了深入而全面地了解植物響應缺鐵的主要基因及相關調控機制，我們通過生物信息學方法分析了擬南芥中參與PYE和FIT1缺鐵調控途徑中的相關基因，建立了相關的調控模型。通過共表達分析，鑒定到11個和PYE共表達的基

9、因（參與PYE途徑），17個和IRT1共表達的基因（參與FIT1途徑）。其中有15個基因（包括PYE和FIT1）已通過分子遺傳學鑒定參與了缺鐵調節(jié)，而另外15個基因(At2g42750、At5g05250、ORG1、At5g38820、At3g12900、At1g74770、CEL5、At2g39040、At3g12540、At1g73120、At3g61410、MYB10、GSTL1、At3g61930)到目前還沒有相關的報道。我們將

10、這些基因視作為缺鐵響應的候選基因。另外，通過啟動子分析及芯片數(shù)據(jù)參考，預測到一些順式元件及相應的轉錄因子(如:ERFs，ABFs，GBFs，ARFs，NACs，WRKYs)參與了PYE和FIT1調控途徑。通過對pye和fit突變體缺鐵芯片數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)PYE不僅能調控自身途徑中的共表達基因，而且對FIT1途徑中的某些基因也有影響，而FIT1只對與IRT1共表達的部分基因有調節(jié)作用。另外，據(jù)已有報道PYE-module中的基因BHLH03

11、9或BHLH101可以和FIT1形成二聚體，從而調控下游基因表達。根據(jù)本文的分析結果，我們建立了擬南芥響應缺鐵調控的模型，并推測PYE調控途徑可以通過BHLH039和BHLH039基因與FIT1調控途徑相互聯(lián)系，并且PYE調控途徑有可能位于FIT1調控途徑的上游，從而有序地調節(jié)植物的缺鐵反應。
　　microRNA(miRNA)是一種非編碼蛋白質的小分子RNA(smallRNA)，主要通過對靶基因的負調控去影響生物學過程。植物響應

12、外界脅迫的過程中也有眾多microRNA參與。為此，我們對響應缺鐵的microRNAs進行了鑒定和分析。2011年已有學者根據(jù)高通量和降解組的數(shù)據(jù)庫對水稻和擬南芥全基因組中miRNA和靶基因的一一對應關系做了預測和分析?；谶@個結果，我們發(fā)現(xiàn)擬南芥的180個缺鐵響應基因中有15個缺鐵響應基因被預測為16個miRNA家族(miR158a、miR164c、miR1887、miR2111ab、miR3933、miR395ade、miR837-

13、3P、miR837-5P、miR861-5P)的靶基因。通過Poly(T)adaptorRT-PCR方法對這16個miRNA成熟片段在缺鐵0，1，3和5d的表達變化做了檢測，結果發(fā)現(xiàn)，除了miR158a和miR837-5P之外，其他的miRNA在缺鐵條件下表達都明顯上調，但miR861-5P和miR857在缺鐵3d時表達才有變化，這可能是缺鐵引發(fā)的次級反應（如氧化脅迫等）誘導的。因此我們把除miR861-5P和miR857以外的12個m