長鏈非編碼RNa-UFC1通過miR34a促進骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨細胞減少及關(guān)節(jié)基質(zhì)破壞為主要病理特點很常見的退行性病變，骨關(guān)節(jié)炎嚴重的患病者可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能完全喪失。該病主要發(fā)生于中老年人群，是老年患者臨床最常見的關(guān)節(jié)類疾病，流行病學(xué)統(tǒng)計結(jié)果顯示我國40歲以上人群的OA患病率約為30％，65歲以上可達60％～70％。隨著我國社會人口老齡化問題的突出，該數(shù)據(jù)仍繼續(xù)在不斷提升中，已成為越來越備受關(guān)注的社會問題。目前，

2、該病尚無明確且有效的根治性的治療手段，臨床上采取的治療手段主要以控制疼痛、改善關(guān)節(jié)的功能和提高生活質(zhì)量為主要目的，首選藥物及理療等保守療法，當保守治療無效時，可行關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)清理、軟骨移植和關(guān)節(jié)置換等外科療法。新的流行病學(xué)證據(jù)表明OA的發(fā)生與發(fā)展除了與年齡直接相關(guān)以外，還受到諸多可調(diào)節(jié)因素的影響，具有可預(yù)防和可治療性。鑒于其病理進程較為復(fù)雜，涉及到的機制也具有多樣化特征，針對OA的不同病理進程及其相關(guān)機制，一些新的治療方案，如軟骨細胞移

3、植術(shù)、骨髓間充質(zhì)干細胞移植術(shù)、基質(zhì)誘導(dǎo)自體軟骨細胞移植術(shù)等已部分進行了臨床開展，并獲得了一些效果，但仍不是十分理想。是以更深入研究OA的病理機制，挖掘更為確切的防治靶點，仍然是當前需要解決的一個難題。
　　長鏈非編碼RNA(Long non coding RNA，Lnc RNA)是非編碼RNA的一個亞類，長度超過200nt，較編碼RNA具有更強的組織特異性和細胞特異性，在不同細胞、組織及其不同發(fā)育階段，表達均有不同，與多種疾病的發(fā)

4、生與發(fā)展密切相關(guān)。部分學(xué)者指出Lnc RNA在OA發(fā)病過程中介導(dǎo)重要機制，并通過基因芯片與高通量DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在軟骨分化過程中有2166個Lnc RNA表達上調(diào)，1472個Lnc RNA表達下調(diào)，為OA的臨床治療提供了新的希望。目前，關(guān)于LncRNA在OA的作用已有較多研究，但病理學(xué)方面仍然有許多未知之處需深入探索。在既往的前期研究工作中也發(fā)現(xiàn)OA患者軟骨細胞的LncRNA-UFC1表達水平低于正常軟骨細胞。在腫瘤性疾病中，UFC1

5、能通過與miR-34a特異性結(jié)合而抑制其活性，解除miR-34a對細胞增殖的抑制作用。miR-34a過表達同時也是OA患者軟骨細胞凋亡和再生障礙的一個重要誘因，但在OA中，UFC1是否能夠與miR-34a特異性結(jié)合，從而促進軟骨細胞增殖尚不得知。
　　本研究分三部分內(nèi)容，首先觀察Lnc-RNA-UFC1對關(guān)節(jié)炎性海綿狀軟骨細胞增殖與凋亡行為的影響，分析Lnc-RNA-UFC1在OA病理機制的是否發(fā)揮了重要作用，確立其研究價值;其次

6、從Lnc-RNA-UFC1與miR-34a相互調(diào)控的角度分析其作用途徑，確定Lnc-RNA-UFC1對OA病理機制介導(dǎo)是否是通過miR-34a來完成的;最后選取miR-34a調(diào)節(jié)OA的相關(guān)下游信號分子，對Lnc-RNA-UFC1通過miR-34a促進軟骨細胞增殖的機制做初步探討，最終為完善OA病理機制和探尋新的治療靶點提供依據(jù)。
　　研究目的：
　　觀察Lnc-RNA-UFC1對關(guān)節(jié)炎性海綿狀軟骨細胞增殖與凋亡行為的影響，并

7、從Lnc-RNA-UFC1與miR-34a相互調(diào)控的角度分析其作用途徑，為完善OA病理機制和探尋新的治療靶點提供依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.OA軟骨細胞的體外培養(yǎng)和樣本選取
　　以30名行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的OA患病者為病理對象取其OA軟骨細胞，20例不曾患OA或者RA（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）預(yù)行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的股骨頸骨折患者的正常軟骨細胞做為對照組，術(shù)中留取軟骨組織。采用兩步酶消化法分離人的軟骨細胞，并進行傳代培養(yǎng)，取

8、2、3、4代細胞各培養(yǎng)14d，制備生長曲線，并采用免疫組織化學(xué)實驗測定軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達情況，選取生長良好、Ⅱ型膠原充足的細胞納入樣本。
　　2.OA軟骨細胞和正常軟骨細胞的UFC1表達和行為學(xué)特征
　　納入實驗的OA軟骨細胞和正常軟骨細胞，采用96孔板培養(yǎng)，37℃，5％CO2培養(yǎng)48h，采用定量實時PCR實驗測定UFC1表達水平，采用CCK-8細胞增殖活力實驗測定細胞增殖活力，采用Annexin V和PI雙染流式細胞實

9、驗測定細胞凋亡率，對比各個指標的組間差異。
　　3.UFC1過表達和沉默對行為學(xué)特征的影響
　　采用siRNA技術(shù)分別構(gòu)建UFC1過表達(UFC1 overexpression)和UFC1干擾慢病毒載體質(zhì)粒（簡稱為shRNA1與shRNA2），轉(zhuǎn)染至OA軟骨細胞。96孔板培養(yǎng)細胞，設(shè)立對照組（Controls1），空載質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組（Controls2）、UFC1組過表達組(UFC1 over expression)及UF

10、C1沉默組（shRNA1與shRNA2）。Controls1僅含OA軟骨細胞、Controls2加入空載質(zhì)粒和脂質(zhì)體共培養(yǎng)、UFC1over expression、shRNA1及shRNA2分別加入相應(yīng)的UFC1-siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物進行共培養(yǎng)，37℃，5％ CO2共培養(yǎng)48h，對比各組細胞細胞增殖活力、細胞凋亡率，繼續(xù)培養(yǎng)，繪制14d生長曲線。
　　4.OA軟骨細胞中UFC1與miR-34a的相關(guān)性考察
　　納入實驗的

11、OA軟骨細胞和正常軟骨細胞，37℃，5％ CO2培養(yǎng)48 h，采用定量實時PCR實驗測定miR-34a表達水平，分析miR-34a mRNA表達與UFC1mRNA表達的相關(guān)性。
　　5.OA軟骨細胞UFC1與miR-34a的相互作用
　　使用脂質(zhì)體2000將pcDNA3.1-MS2，pcDNA3.1-MS2-UFC1或者pcDNA3.1-MS2-UFC1-mut和pMS2-GFP細胞進行共轉(zhuǎn)染，37℃，5％ CO2培養(yǎng)48h

12、后，再以EZ-Magna RIPRNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒對細胞使用GFP抗體進行RIP分析。并將原代或者變異全長型UFC1克隆到pmirGLO質(zhì)粒受體中，以上所有原代與變異的受體攜帶體和模擬生物體內(nèi)源miR-34a均被導(dǎo)入細胞中，在37℃，5％ CO2培養(yǎng)48h后，通過雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測量熒光素活性。
　　6.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細胞的行為學(xué)特征
　　進行靶向干預(yù)實驗，96孔板培養(yǎng)細胞，設(shè)立對照組

13、（Controls）、UFC1沉默組（shRNA1與shRNA2）、miR-34a抑制劑干預(yù)組(miR-34a inhibitor)、UFC1過表達組(UFC1 over expression)和miR-34a干預(yù)組(miR-34a); Controls正常培養(yǎng);shRNA1、shRNA2和miR-34a inhibitor均采用siRNA實驗構(gòu)建UFC1干擾質(zhì)粒，且miR-34a inhibitor額外添加miR-34a抑制劑;UFC

14、1 over expression和miR-34a均采用siRNA實驗構(gòu)建UFC1過表達質(zhì)粒，且miR-34a額外添加miR-34a，37℃，5％CO2培養(yǎng)48 h，測定細胞增殖活力、凋亡率及14d生長曲線。
　　7.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細胞的行為學(xué)的機制研究
　　進行靶向干預(yù)實驗，96孔板培養(yǎng)細胞，設(shè)立對空白對照組（Controls1）、空載質(zhì)粒組（Controls2）、UFC1沉默組(shRNA)、mi

15、R-34a抑制劑組(miR-34ainhibitor)。Controls1僅OA軟骨細胞;Controls2同時含有OA軟骨細胞和空白脂質(zhì)體質(zhì)粒;shRNA以siRNA轉(zhuǎn)染實驗沉默UFCI（取第一、二部分實驗的shRNA1，重新命名為shRNA），miR-34a inhibitor在沉默UFC1的基礎(chǔ)上加入miR-34a inhibitor，37℃，5％ CO2，培養(yǎng)72 h分別以熒光定量PCR實驗和免疫蛋白印跡(WB)實驗測定ADAM

16、TS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-9、MMP-13的mRNA表達水平及蛋白表達水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.OA軟骨細胞的體外培養(yǎng)和樣本選取
　　軟骨細胞于培養(yǎng)的第3d左右開始生長，7～10 d生長速率達到頂峰，之后由于進入減速期，第2、3代細胞的生長狀況明顯優(yōu)于4代。對各代細胞的Ⅱ型膠原進行免疫組織化學(xué)染色實驗，2代細胞著色良好;3代細胞著色減弱，但仍見較清晰的陽性細胞;4代細胞著色差，已發(fā)生較大程度

17、的變異，故以第2、3代細胞作為主要樣本。
　　2.OA軟骨細胞和正常軟骨細胞的UFC1表達和行為學(xué)特征
　　OA患者軟骨細胞的UFC1 mRNA表達水平明顯低于正常軟骨細胞，細胞增殖活力低于正常的軟骨細胞，細胞凋亡率高于正常的軟骨細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.UFC1過表達和基因沉默對行為學(xué)特征的影響
　　UFC1過表達組OA軟骨細胞組的UFC1表達量明顯高于未轉(zhuǎn)染組（Controls1，P＜

18、0.01），同時，細胞生長速率和增殖活力明顯提高，凋亡率降低，與Controls1相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;shRNA1和shRNA2OA軟骨細胞的UFC1表達量明顯低于未基因沉默者（Controls1，P＜0.01），同時，細胞生長速率和增殖活力明顯降低，凋亡率升高，與Controls1相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.OA軟骨細胞中UFC1與miR-34a的相關(guān)性考察
　　OA患者軟骨細胞miR

19、-34a mRNA表達水平明顯高于正常軟骨細胞(P＜0.05)，進一步分析結(jié)果顯示，OA患者軟骨細胞miR-34a mRNA表達與UFC1 mRNA表達具有負相關(guān)性(R2=0.6173，P＜0.05)。
　　5.OA軟骨細胞UFC1與miR-34a的相互作用
　　RIP法下調(diào)UFC1的內(nèi)源性microRNA水平后，UFCI在軟骨組織中的RIP水平與空白組相比miR-34a水平顯著增加(MS2)，UFCI在miR-34a作用靶

20、點發(fā)生突變(UFCI-mut)。熒光素酶受體分析結(jié)果顯示miR-34a的過度表達減少了原代受體因子的熒光素酶活性，而不是空載體或者突變受體載體。由AGO2下調(diào)的UFC1在miR-34a過度表達的細胞中含量顯著增加，且原代UFC1過度表達而并非變異體抑制了miR-34a水平。
　　6.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細胞的行為學(xué)特征
　　與Controls相比，shRNA1和shRNA2OA軟骨細胞的生長速率減慢，增殖活

21、力降低，凋亡率升高;給予miR-34a inhibitor后，OA軟骨細胞的生長速率增快，增殖活力升高，凋亡率降低;各組間的比較明顯存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。與Controls相比，UFC1 over expression OA軟骨細胞的生長速率增快，增殖活力升高，凋亡率降低;經(jīng)miR-34a干預(yù)后，OA軟骨細胞的生長速率減低，增殖活力降低，凋亡率升高，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　7.UFC1通過miR-3

22、4a調(diào)控OA軟骨細胞的行為學(xué)的機制研究
　　與Control1相比，Control2的各個指標水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;shRNA的ADAMTS-4 mRNA和蛋白表達水平明顯升高，而給予miR-34a抑制劑后(miR-34a inhibitor)明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;而同法測定shRNA的ADAMTS-5 mRNA組間均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;shRNA的MMP-3、MMP-9與

23、MMP-13 mRNA和蛋白表達水平明顯升高，而給予miR-34a抑制劑后(miR-34a inhibitor)明顯降低，均發(fā)現(xiàn)組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究對OA軟骨細胞和正常軟骨細胞的LncRNA-UFC1表達情況進行考察，并通過獲得性喪失研究LncRNA-UFC1對軟骨細胞的行為學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)LncRNA-UFC1能夠促進OA軟骨細胞的增殖活性，抑制其凋亡率，促進軟骨細胞生長，在O

24、A的病理機制中可能介導(dǎo)重要作用。
　　2.LncRNA-UFC1對OA病理的調(diào)控可能與miR-34a有關(guān)，LncRNA-UFC1與miR-34a結(jié)合后使其表達沉默，功能受到抑制，從而促進了OA軟骨組織的細胞增殖并抑制其細胞凋亡，對該機制的深入研究，有可能會為OA的臨床上的診治提出新的靶點。
　　3.LncRNA-UFC1與miR-34a結(jié)合后，能抑制其下游信號分子ADAMTS-4、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達，