人oGPCRs-Gi1α融合蛋白的表達及GPR80的功能初探.pdf

1、G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors,GPCRs),因介導細胞間通訊和細胞內信息傳遞而具有重要的生理功能和病理意義。GPCR一直是最重要的藥物靶點,也是藥理學研究的重要內容。據測算,人類GPCR的總數在900個左右。其中,配基與功能均屬未知的GPCR,即孤兒GPCRs(orphan GPCRs,GPCRs),大約有100個左右。
　　鑒于GPCR的重要性,如何篩選確認oGPCR的配基,進而探索其功

2、能已成為oGPCR研究領域的關鍵內容。前者,通常被形象地稱為oGPCR的“去孤兒化”(Deorphanization)。本研究主要包括兩部分:一是利用GPCR與G蛋白偶聯的特性,將幾個oGPCR分子與G蛋白亞基進行融合并表達融合蛋白,為實現oGPCR的配基篩選奠定基礎;二是對新近“去孤兒化”的GPR80受體進行了功能初探。主要結果總結如下。
　　在本實驗第一部分中,根據oGPCR數據庫的信息,分別克隆人孤兒受體成員GPR45(Ge

3、nBank Accession number: NM_007227),GPR85(GenBank Accession number:NM_018970),GPR174(GenBank Accession number:NM_032553)與Gi1a的完整編碼區(qū),測序完全正確后,通過重疊延伸(splicing by overlap extension, SOE)PCR技術將二者進行融合,然后將融合基因克隆到供體質粒pFASTBac1中,而

4、后轉化DH10Bac,使含融合基因的重組供體質粒實現位點的特異性轉座,得到重組桿狀病毒穿梭質粒。將該重組桿粒轉染昆蟲 sf9細胞,制備含有重組桿狀病毒母株的上清。利用合適滴度的病毒上清,感染 sf9細胞一定時間。經Wester Blot檢測證實,sf9細胞成功表達了相應的oGPCRs-Gi1α融合蛋白。而且,在重組病毒感染強度(multiplicity of infection,moi)為5、感染時間為72h的條件下,各融合蛋白的表達含

5、量較為豐富。
　　在本實驗第二部分中,我們探討了GPR80受體在腎小管上皮-間充質轉分化(Epithelial-mesenchymal transdifferentiation, EMT)中的可能作用。GPR80是新近實現“去孤兒化”的oGPCR成員。我們選擇人近端腎小管上皮細胞系HK-2細胞為研究對象,分別在低糖(5mM)和高糖(30mM)條件下探索TGFβ-1與EMT的關系。然后利用TGF-β1(5ng/ml)誘發(fā)的HK-2細

6、胞 EMT病變模型,著重觀察了高糖(30mM)條件下a-酮戊二酸鈉對HK-2細胞EMT病變的影響。結果發(fā)現,a-酮戊二酸鈉在100和500μM時均明顯抑制EMT病變的發(fā)生發(fā)展,表現為上皮標志物E-cadherin表達顯著升高(P<0.01),間葉組織標志物 Vimentin表達顯著降低(P<0.01),此過程還伴隨著其受體GPR80的表達上調。本發(fā)現結果首次證實,a-酮戊二酸鈉具有逆轉EMT的作用,預示著a-酮戊二酸(鹽)及其受體介入了