VEGF-A與SB-431542聯(lián)合誘導(dǎo)SHEDs分化為Ecs的初步研究.pdf

1、目的:體外獲取和分離人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞并采用胰酶消化、有限稀釋法對(duì)其純化，培養(yǎng)并分析干細(xì)胞干性;采用VEGF-A與SB-431542聯(lián)合誘導(dǎo)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞，初步探討其分化為內(nèi)皮細(xì)胞的高效性，為研究牙源性干細(xì)胞高效分化內(nèi)皮細(xì)胞提供一種新思路。
　　方法:
　　1、人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞的獲取、分離、純化、培養(yǎng)及細(xì)胞干性鑒定
　　選取山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院兒牙科因滯留而拔除的健康乳前牙，在無(wú)菌狀態(tài)下獲取滯留乳牙牙髓組織，

2、并采用胰酶消化法獲取單細(xì)胞的懸液，有限稀釋法進(jìn)行分離、純化。倒置顯微鏡下觀察人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞原代、傳代細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析CD45、CD73、CD90、CD105表面抗原陽(yáng)性表達(dá)情況。選取第三代處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞，體外成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，向脂肪組織分化。觀察細(xì)胞形態(tài)變化及胞內(nèi)成脂情況，4周后油紅-0染色。選取第三代人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞，體外成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，第1周和第3周分別行堿性磷酸酶和茜素紅染色

3、，檢測(cè)是否有礦化結(jié)節(jié)的形成，進(jìn)一步鑒定人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞多向分化能力。
　　2、體外VEGF-A與SB-431542聯(lián)合誘導(dǎo)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化:將處在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的第三代人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞以3×103個(gè)/cm2分別接種于α-MEM、VEGF-A、VEGF-A+SB-431542聯(lián)合培養(yǎng)基中，隔天更換一次培養(yǎng)液，分別提取第7天、第14天的上述細(xì)胞，RT-PCR、Western blot分別檢測(cè)三組實(shí)驗(yàn)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基

4、因、蛋白表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)分析:所有實(shí)驗(yàn)組一式三份進(jìn)行，所有數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來(lái)表示。使用單因素方差分析確定是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，并將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的閾值設(shè)定為P＜0.05。
　　結(jié)果:
　　1、酶消化法和有限稀釋法獲得了純的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞，顯微鏡下人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD45陽(yáng)性檢出率為2.8％，CD73陽(yáng)性檢出率為99.8％，CD90陽(yáng)性檢出率為99.5

5、％，CD105陽(yáng)性檢出率為94.2％。人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)4周后，油紅-0染色陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)橙紅色顆粒。成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，有鈣化結(jié)節(jié)逐漸形成，茜素紅染色呈現(xiàn)橘紅色或深紅色;ALP染色細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色。
　　2、實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)結(jié)果顯示:誘導(dǎo)7天、14天無(wú)論是單純的VEGF-A組還是VEGF-A+SB-431542組，均有特異性內(nèi)皮細(xì)胞分子（VEGFR-2、VEGFR-1、Ephrin

6、B2和Tie-2）的表達(dá)。誘導(dǎo)7天后，與單純VEGF-A組相比，用VEGF-A和SB-431542聯(lián)合培養(yǎng)的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞顯示出更高的VEGFR-2表達(dá)（P＜0.05)，VEGFR-1、CD31也呈現(xiàn)出相似的高表達(dá)狀態(tài)。與單獨(dú)的VEGF-A組相比，人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞在含有VEGF-A和SB-431542培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天后內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因（VEGFR-2、VEGFR-1、EphrinB2和Tie-2）表達(dá)顯著增加（P＜0.0

7、5）。Western blot檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況:培養(yǎng)7天和14天，VEGF-A組及VEGF-A+SB-431542組均能產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞的特異性蛋白(CD31和VEGFR-2)。但無(wú)論是第7天還是第14天，聯(lián)合組誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)量均高于VEGF-A單純組。
　　結(jié)論:
　　1、體外獲取、分離并采用酶消化法和有限稀釋法可以獲得純的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞表達(dá)早期的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)