“黃連-干姜”藥對預防炎癥性腸病及其相關結腸癌作用機制研究.pdf

1、目的:
　　炎癥性腸病是一種腸道的慢性復發(fā)性炎癥性疾病，主要包含克羅恩病(Crohn'sDisease，CD)和潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis，UC)，主要癥狀為腹痛、腹瀉、黏液便及膿血便，大約一半的嚴重病例需要手術治，并且常常伴隨嚴重的并發(fā)癥，持續(xù)的慢性炎癥還可以增加結直腸癌的發(fā)病風險，嚴重影響患者生活質量，并且，有研究表明，結直腸癌的發(fā)病風險與腸道炎癥的嚴重程度和持續(xù)時間成正相關。
　　黃連在治療胃腸

2、道炎癥方面有著突出的優(yōu)勢，無論是結腸炎還是結腸癌均有一定的療效，但是黃連為苦寒之品，長期服用會帶來一些不良反應。“黃連-干姜”藥對在中醫(yī)臨床上體現(xiàn)了寒溫并用的思想，是導師在臨床常用的一種配伍，能夠緩解長期應用苦寒藥治療慢性疾病帶來的一系列不良反應。本研究采用DSS誘導的小鼠結腸炎模型、巨噬細胞RAW264.7細胞和結腸癌細胞系HT29、HCT116作為研究對象，探討“黃連-干姜”藥對預防結腸炎的作用及機制，以及其對結腸癌細胞的促凋亡作用

3、及機制。
　　方法:
　　1.“黃連-干姜”藥對主要化學成分的研究
　　按1∶1比例稱取干姜、黃連共400g，加8倍量水，冷浸1h，微沸回流1h，傾出藥液，再加7倍量水，微沸回流30min，傾出藥液，合并兩次的藥液，濾紙過濾，減壓濃縮，冷凍干燥，稱量凍干粉重量為31.8g，備用。稱取1g上述全方藥凍干粉，加ddH2O20.96 Ml，離心(14000 rpmx30 min)，取上清液，即得含有0.6g/ml原藥的溶液。

4、根據文獻，組建黃連和干姜兩味藥的化學成分信息庫。建立“黃連-干姜”液質聯(lián)用(UPLC/Q-TOF-MSS)的分析方法，并運用該方法對“黃連-干姜”化學成分進行分析。根據色譜保留時間、精確分子量、分子碎片峰、對照品信息和自建的兩味組方藥材的化學成分信息庫，對主要色譜峰的來源進行了歸屬和鑒定，并且定量測定水提物中berberine和6-gingerol的含量。
　　2.“黃連-干姜”藥對預防DSS誘導的小鼠結腸炎作用及機制研究

5、　　將45只雄性C57BL/6小鼠隨機分為空白組、模型組、中藥低劑量[1.2g/(kg·d)]組、中藥中劑量[2.4g/(kg·d)]組、中藥高劑量[4.8g/(kg· d)]組，中藥組預防性灌胃給藥7d后（空白組和模型組灌胃等量生理鹽水），在繼續(xù)給予相應干預的同時，模型組、中藥組分別給予3％DSS(Dextran Sulfate Dodium)水溶液自由飲用，每2d更換一次，連續(xù)飲用7d，空白組小鼠給予自來水自由飲用。記錄每日疾病活動

6、指數(shù)(Disease Activity Index DAI)評分，取材后測量結腸長度，HE染色觀察結腸病理變化并記錄病理組織學評分，計算臟器指數(shù)，ELISA法檢測小鼠血漿中IL-6和TNF-α水平，Western blot法檢測結腸上皮細胞中NF-κB、JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平，激光共聚焦顯微鏡檢測結腸組織中NF-κB和p-STAT3表達水平。
　　3.“黃連-干姜”藥對預防LPS誘導RAW264.7細胞炎癥反應及其機制

7、研究
　　MTT法檢測0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml“黃連-干姜”水提物對巨噬細胞RAW264.7細胞的殺傷作用。預防性給予“黃連-干姜”水提物(0、0.5、1、2mg/ml)1h后，給予LPS刺激8h，ELSIA法檢測培養(yǎng)基IL-6和TNF-α的含量，Westernblot法檢測RAW264.7細胞中STAT3磷酸化水平，免疫熒光法檢測RAW264.7細胞中p-STAT3和NF-κ B表達水平。

8、>　　4.“黃連-干姜”對結直腸癌細胞系HT29和HCT116的作用及機制研究
　　MTT法檢測0、1、2、4、6、8、15mg/ml“黃連-干姜”水提物對HT-29和HCT116細胞的殺傷作用，給予“黃連-干姜”水提物0、1、1.5mg/ml分別干預HT-29和HCT116細胞48h后，流式細胞儀PI/AnnexinⅤ-FITC雙染色法檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測Cleaved Caspase3蛋白表達水平和S

9、TAT3蛋白磷酸化水平。
　　結果:
　　1.“黃連-干姜”藥對主要化學成分的研究
　　建立了“黃連-干姜”藥對液質聯(lián)用的分析方法，并成功運用該方法對“黃連-干姜”藥對化學成分進行了分析。根據色譜保留時間、精確分子量、分子碎片峰、對照品信息和自建的兩味組方藥材的化學成分信息庫，對主要色譜峰的來源進行了歸屬和鑒定，歸屬并鑒定了28個主要色譜峰，同時定量檢測了berberine的濃度為54.43mM，6-gingerol藥

10、物濃度為2.2mM。
　　2.“黃連-干姜”藥對預防DSS誘導的小鼠結腸炎作用及機制研究
　　模型組動物在飲用3％DSS后從第2天開始，DAI較空白組均升高;與模型組比較，中藥低劑量組在造模后DAI均降低，但僅在飲用3％DSS第2、4、6天差異才有統(tǒng)計學意義;中藥中劑量組DAI于飲用3％DSS后除了第4天，均低于模型組，并持續(xù)至實驗結束;中藥高劑量組DAI于飲用3％DSS第2天即低于模型組，并持續(xù)至實驗結束。
　　模型

11、組小鼠結腸長度較空白組明顯縮短(P＜0.01);與模型組相比，中藥低、中劑量組結腸長度增長(P＜0.05)，中藥高劑量組結腸長度顯著增長(P＜0.01)。模型組結腸組織病理評分較空白組顯著升高（P＜0.01）;與模型組相比，中藥低劑量組結腸組織病理評分無明顯變化，中藥中劑量組結腸組織病理評分降低（P＜0.05），中藥高劑量組結腸組織病理評分顯著降低(P＜0.01)。
　　模型組小鼠血漿中IL-6含量較空白組顯著上升（P＜0.01）

12、;與模型組相比，中藥各個劑量組小鼠血漿中IL-6含量較模型組均顯著降低（P＜0.01）。與空白組相比，模型組血漿中TNF-α含量顯著上升（P＜0.01），與模型組相比，中藥各個劑量組小鼠血漿中TNF-α含量較模型組均顯著降低（P＜0.01）。
　　結腸組織中NF-κB、JAK2和STAT3蛋白活化水平模型組均顯著高于空白組(P＜0.01);中藥低、高劑量組小鼠腸上皮細胞中NF-κB蛋白磷酸化水平均比模型組明顯降低(P＜0.01);

13、和模型組相比，中藥低、高劑量組腸上皮細胞中JAK2蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），中藥各個劑量組腸上皮細胞中STAT3蛋白磷酸化水平顯著降低(P＜0.01)。
　　3.“黃連-干姜”藥對預防LPS誘導RAW264.7細胞炎癥反應及其機制研究
　　MTT結果顯示“黃連-干姜”水提物作用36h對RAW264.7細胞半數(shù)致死濃度為3.79mg/ml，ELSIA結果發(fā)現(xiàn)“黃連-干姜”水提物可以顯著抑制LPS誘導的RAW264

14、.7細胞炎癥因子IL-6和TNF-α分泌水平，Western blot和免疫熒光結果顯示“黃連-干姜”可以顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中NF-κB和STAT3蛋白的激活。
　　4.“黃連-干姜”對結直腸癌細胞系HT29和HCT116的作用及機制研究
　　MTT結果顯示“黃連-干姜”水提物可以顯著抑制HT29和HCT116細胞的活力，作用48h的IC50分別為5.648mg/ml和2.43mg/ml。流式細胞儀檢測

15、發(fā)現(xiàn)“黃連-干姜”水提物可以顯著促進HT29和HCT116的凋亡比率，Western blot結果顯示“黃連-干姜”可以顯著促進HT29和HCT116細胞中Cleaved Caspase3的表達，抑制STAT3蛋白的磷酸化。
　　結論:
　　1.“黃連-干姜”藥對水提物可以顯著抑制DSS誘導的小鼠結腸炎模型癥狀體征，改善局部病理損傷，抑制DSS誘導的小鼠結腸炎模型血漿炎癥因子的含量，其作用機制可能是通過抑制DSS誘導的小鼠結

16、腸炎模型結腸局部NF-κB信號通路及JAK2/STAT3信號通路的激活而起作用。
　　2.“黃連-干姜”可以顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌，可能是通過抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中NF-κB和JAK2/STAT3信號通路的激活而起到了作用。
　　3.“黃連-干姜”藥對可以顯著抑制結腸癌細胞系HT29和HCT116的增殖，促進結腸癌細胞系HT29和HCT116的凋亡，可能是通