加味芍藥甘草湯對子宮腺肌病裸鼠miR-27a調控的P53-EGFR-STAT3通路的干預機制.pdf

1、背景:
　　子宮腺肌病(adenomyosis，AM)是子宮內膜腺體和間質侵入到子宮肌層內定植并增生而形成的一種雌激素依賴性疾病，近年來其發(fā)病率呈不斷上升趨勢，已成為婦科常見疑難病。漸進性痛經(jīng)、不孕為其最主要的臨床表現(xiàn)，痛經(jīng)發(fā)生率高達77.8％，嚴重影響患者生活、工作等。根治療法目前僅有全子宮切除術，但不易被患者所接受，尤其是年輕且有生育要求的患者;西醫(yī)藥物治療副作用大，服藥期間不能孕育，停藥后痛經(jīng)等癥狀容易復發(fā)，因此尋求一種有效

2、療法迫在眉睫，而中醫(yī)藥在緩解或消除痛經(jīng)癥狀、提高患者生存質量和生育能力、副作用小、遠期療效穩(wěn)定等方面顯示了獨特的優(yōu)勢。多年來，眾多學者和專家探索運用中醫(yī)藥治療子宮腺肌病，在理論創(chuàng)建和臨床實踐方面多有建樹，為后來的研究者提供了良好的基礎。
　　目的:
　　1.建立人來源型子宮腺肌病裸鼠模型，為深入研究子宮腺肌病發(fā)病機制、病理特點以及探索有效的治療方案提供理想的動物模型。
　　2.本課題擬通過動物實驗觀察加味芍藥甘草湯影響

3、下miR-27a對裸鼠病灶組織中P53/EGFR/STAT3信號通路相關因子的調控作用，以期闡明加味芍藥甘草湯治療子宮腺肌病的深層作用機理，對深入了解子宮腺肌病的病因病理，指導臨床辨證用藥，為子宮腺肌病新藥研發(fā)提供科學依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.采用腹腔移植法建立人來源性子宮腺肌病裸鼠模型，并運用HE染色及免疫組織化學法檢測波形蛋白及角蛋白鑒定造模結果。
　　2.運用人來源性子宮腺肌病裸鼠模型，建立手術對照組模型作

4、為對照。將實驗裸鼠隨機分為手術對照組、模型組、米非司酮組、加味芍藥甘草湯高劑量組、加味芍藥甘草湯中劑量組、加味芍藥甘草湯低劑量組分別用藥干預，3周后取材。
　　3.測量各組裸鼠病灶組織最大直徑(L)及最大橫徑(W)，計算病灶體積(V)，V=L×W2/2，比較各組體積差異;
　　4.采用免疫組化法檢測各組裸鼠病灶組織p53蛋白表達差異;
　　5.采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組裸鼠病灶組織p53-2

5、73H、c-Src、LIF、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、COX-2的表達差異;
　　6.采用RT-qPCR技術檢測各組裸鼠病灶組織p53-273HmRNA、miR-27a、EGFR mRNA、LIFR mRNA的表達差異。
　　結果:
　　1.使用腹腔種植法建立人來源性子宮腺肌病裸鼠模型外觀、體積、組織病理學以及波形蛋白、角蛋白的表達情況，均符合子宮腺肌病的特征，可以認為人來源性子宮腺肌病裸鼠模

6、型建立成功。
　　2.各組間的裸鼠腹腔內移植組織體積的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組裸鼠的腹腔內移植組織體積較其余各組大（P＜0.05）;米非司酮組與加味芍藥甘草湯各劑量組之間均無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.采用免疫組織化學法檢測加味芍藥甘草湯對各組間的裸鼠腹腔內移植組織中P53蛋白的表達的影響，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），手術對照組裸鼠移植組織內P53表達量低于其余各組（P＜0.01）;

7、模型組裸鼠移植組織內P53表達高于其余各組(P＜0.05)。
　　4.采用Western Blot法檢測各組間的裸鼠腹腔內移植組織中p53-273H、c-Src、LIF、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、COX-2蛋白的表達量，均有統(tǒng)計學意義。模型組中P53-273H蛋白表達量高于其余各組（P＜0.05）。模型組中LIF表達較其余各組高（P＜0.05）;手術對照組中EGFR表達較其余各組低（P＜0.05）;模型組

8、中P-EGFR高于其余各組(P＜0.05);模型組中c-Src表達量高于其余各用藥組（P＜0.05），手術對照組中P-STAT3表達較其余各用藥組低（P＜0.05）。P53-273H、c-Src、STAT3、P-STAT3蛋白米非司酮組及加味芍藥甘草湯各劑量組之間無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　5.RT-qPCR法檢測各組間的裸鼠腹腔內移植組織中p53-273HmRNA、miR-27a、EGFRmRNA、LIFR mRNA

9、的相對表達量，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。米非司酮組中miR-27a mRNA的相對表達量最高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。加味芍藥甘草湯高劑量組及加味芍藥甘草湯中劑量組的EGFR mRNA表達量低于模型組（P＜0.05）。加味芍藥甘草湯低劑量組中P53-273H mRNA的相對表達量較米非司酮組低（P＜0.05），模型組中P53-273H mRNA的相對表達量高于其它各組（P＜0.05）。模型組中LIFR表達較其余各用藥

10、組高（P＜0.05）。
　　6.通過miR-27a對P53/EGFR/STAT3信號通路的調控作用機制相關性分析，P53-273H基因與miR-27a中度負相關，miR-27a與其他基因都呈輕度負相關，而P53-273H與其他基因都輕度相關。
　　結論:
　　1.腹腔種植法建立人來源性子宮腺肌病裸鼠模型，該造模方法穩(wěn)定性良好，可重復性高，且能夠模擬子宮腺肌病病灶在腹腔內自然生長過程以及腹腔微環(huán)境的變化，是一種提高子宮腺

11、肌病建模成功率、符合人體機制的新方法，能夠為探索子宮腺肌病病理生理機制以及治療方法提供理想的動物模型。
　　2.加味芍藥甘草湯能夠有效縮小人來源型子宮腺肌病裸鼠模型腹腔內病灶組織的體積，并且降低病灶組織內P53、EGFR、P-EGRG、STAT3、P-STAT3、COX-2蛋白的表達，能夠抑制子宮腺肌病細胞的增殖，減少病灶組織內血管的新生。因此，臨床運用加味芍藥甘草湯治療子宮腺肌病可以限制或延緩子宮腺肌病的發(fā)展和侵襲。