宮頸癌APE1與ZEB1和PD-L1相互作用及臨床意義研究.pdf

1、宮頸癌是嚴(yán)重危害我國婦女健康的惡性腫瘤之一。宮頸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者治療失敗的主要原因。上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮著重要作用[1，2]。EMT以上皮細(xì)胞極性的喪失及間質(zhì)特性的獲得為重要特征，為上皮細(xì)胞獲得遷移能力的最主要的方式。脫嘌呤/脫嘧啶內(nèi)切核酸酶1(APE1)不僅能修復(fù)DNA的損傷還具有氧化還原活性，激活許多轉(zhuǎn)

2、錄因子，在FIGO分期較高、分化越低、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者APE1表達(dá)增高[3]，提示APE1參與了宮頸癌的進(jìn)展。EMT作為腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，研究證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌中APE1參與調(diào)控了EMT[4]，然而在宮頸癌中APE1是否調(diào)控EMT及其調(diào)控的具體分子機(jī)制尚不完全清楚。因此本研究擬利用特異性抑制劑和基因敲除細(xì)胞株，通過運(yùn)用蛋白功能位點(diǎn)突變、CO-IP、凝膠遷移電泳(EMSA)和免疫熒光以及裸鼠成瘤等技術(shù)，深入研究APE1在宮頸癌E

3、MT中具體分子機(jī)制，對進(jìn)一步闡明宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)理以及今后可能的靶點(diǎn)干預(yù)具有重要的的科學(xué)意義。
　　免疫治療不僅在其它腫瘤治療中有著顯著的療效，同樣在宮頸癌中也顯示出了光明的前景。程序性死亡配體-1(PD-L1)為B7家族的一個(gè)成員，是由抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)，具有抑制T淋巴細(xì)胞激活的功能。PD-L1通過與其受體結(jié)合，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞無反應(yīng)性和/或凋亡[5-8]。前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)APE1與PD-L1在表達(dá)上存在相關(guān)性，且分別與腫瘤的轉(zhuǎn)移

4、存在關(guān)聯(lián)[9-12]。然而在宮頸癌中，至今尚未有文獻(xiàn)系統(tǒng)詳細(xì)報(bào)道早期宮頸癌中APE1和PD-L1的表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后之間的關(guān)系。本研究中檢測了PD-L1和APE1在早期宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況，分析了兩者之間相關(guān)性及其臨床意義，為APE1與PD-L1可能存在的相互調(diào)控機(jī)制的研究提供臨床依據(jù)。
　　目的:
　　1.明確APE1是否參與調(diào)控宮頸癌EMT，探索APE1參與宮頸癌EMT的具體分子機(jī)制。
　　2.探討早

5、期宮頸鱗癌中APE1與PD-L1表達(dá)相關(guān)性以及與臨床病理因素的相關(guān)性。
　　3.在早期宮頸鱗癌中APE1與PD-L1表達(dá)具有相關(guān)性，兩者均高表達(dá)時(shí)早期宮頸鱗癌患者預(yù)后較差，APE1與PD-L1在早期宮頸鱗癌的進(jìn)展中發(fā)揮了一定的作用。APE1與PD-L1的表達(dá)聯(lián)合檢測對早期宮頸鱗癌預(yù)后的評估具有潛在價(jià)值。
　　內(nèi)容和方法:
　　1.APE1及其氧化還原功能對宮頸癌EMT的影響:以APE1SiRNA干擾宮頸癌細(xì)胞株APE1

6、表達(dá)以及APE1穩(wěn)定敲低型、氧化還原功能缺陷型細(xì)胞為研究對象，利用Western blot、免疫熒光、transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)以及裸鼠實(shí)驗(yàn)觀察APE1及其氧化還原功能對宮頸癌EMT的影響。
　　2.APE1與ZEB1相互作用的機(jī)制研究:利用HA標(biāo)簽的APE1真核質(zhì)粒以及FLAG標(biāo)簽的ZEB1真核質(zhì)粒、APE1SiRNA以及APE1redox功能抑制劑E3330等，運(yùn)用免疫共沉淀的方法雙向驗(yàn)證APE1與ZEB1相互結(jié)合，利用

7、電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)揭示APE1及其氧化還原功能可影響ZEB1與目的基因的結(jié)合能力，影響目的基因E-cadherin的表達(dá)。
　　3.APE1與PD-L1在早期宮頸鱗癌中的表達(dá)相關(guān)性及臨床意義:收集64例FIGO分期為Ⅰ期或Ⅱa期的并行手術(shù)治療的早期宮頸鱗癌患者臨床資料、隨訪信息以及手術(shù)組織標(biāo)本。免疫組化染色APE1與PD-L1抗體，SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，APE1與PD-L1表達(dá)與臨床特征關(guān)系使用卡方檢驗(yàn)，Spearm

8、an等級相關(guān)分析APE1與PD-L1表達(dá)相關(guān)性，患者生存時(shí)間使用Kaplan-Meier法分析，多因素采用Cox回歸評估各臨床病理參數(shù)對預(yù)后的相對危險(xiǎn)度。
　　結(jié)果:
　　1.宮頸癌中APE1氧化還原功能調(diào)控ZEB1介導(dǎo)的EMT:APE1及其氧化還原功能可促進(jìn)EMT的發(fā)生，增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，并且APE1與ZEB1可形成蛋白復(fù)合物，APE1的氧化還原功能并不調(diào)控ZEB1的表達(dá)，而是影響ZEB1的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而影響目的基

9、因E-cadherin的表達(dá)。
　　2.APE1與PD-L1在早期宮頸鱗癌中表達(dá)具有相關(guān)性且與宮頸癌的進(jìn)展有關(guān):早期宮頸癌患者APE1和PD-L1蛋白表達(dá)陽性率分別為70.31％和67.18％。PD-L1的表達(dá)與分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，而APE1的表達(dá)僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P=0.038)。另外，APE1與PD-L1的表達(dá)正相關(guān)(r2=0.347，P=0.005)，且兩者共表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，其術(shù)后生存期