子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中p16異常表達(dá)的分子病理機(jī)制研究.pdf

1、子宮頸癌是女性最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，居女性惡性腫瘤第二位，我國(guó)是子宮頸癌高發(fā)區(qū)。大量研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV感染是子宮頸癌發(fā)生的必要條件，HPV陽(yáng)性子宮頸上皮內(nèi)瘤變及鱗狀細(xì)胞癌p16表達(dá)較正常宮頸上皮明顯升高，但其異常表達(dá)的分子機(jī)制及意義不明，本課題分別以HPV16陽(yáng)性的子宮頸鱗癌Caski及HPV陰性的高分化宮頸鱗癌HCC94細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)子宮頸鱗癌p16表達(dá)升高的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　首先設(shè)計(jì)HPV

2、16E6/E7特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增E6/E7基因，構(gòu)建E6/E7基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HPV16E67。采用脂質(zhì)體法將HPV16E6/E7基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)照空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HCC94細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、Western blotting法分別檢測(cè)兩組HCC94細(xì)胞中E6/E7及p16ink4a基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。設(shè)計(jì)合成E6/E7基因特異性shRNA干擾質(zhì)粒，將干擾質(zhì)粒及空質(zhì)粒載體經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染至

3、caski細(xì)胞中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、Western blotting法分別檢測(cè)兩組caski細(xì)胞中E6/E7基因沉默效率及p16ink4a基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)E6/E7的HCC94細(xì)胞中，E6/E7及p16ink4a基因在mRNA和蛋白水平上表達(dá)量均有明顯上升;在沉默E6/E7的caski細(xì)胞中，E6/E7及p16ink4a基因在mRNA和蛋白水平上表達(dá)量均有明顯下降。
　　進(jìn)一步探究E6、E7基

4、因單獨(dú)過(guò)表達(dá)與沉默對(duì)p16ink4a基因表達(dá)水平的影響，我們構(gòu)建了E7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，E6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及E6、E7干擾RNA（由天一輝遠(yuǎn)公司幫助合成）。分別將E6、E7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒載體經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至HCC94細(xì)胞中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別檢測(cè)三組HCC94細(xì)胞中E6、E7及p16ink4a基因mRNA表達(dá)水平，Western blotting法分別檢測(cè)三組HCC94細(xì)胞中E6、E7及p16ink4a蛋白表達(dá)水平。分別將E6、E7特

5、異性siRNA及負(fù)對(duì)照RNA轉(zhuǎn)染至caski細(xì)胞中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別檢測(cè)三組caski細(xì)胞中E6、E7及p16ink4a基因mRNA表達(dá)水平，Western blotting法分別檢測(cè)三組caski細(xì)胞中E6、E7及p16ink4a蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組及單獨(dú)過(guò)表達(dá)與沉默E6基因組并未引起p16ink4a基因在HCC94和caski細(xì)胞中表達(dá)量的改變;單獨(dú)過(guò)表達(dá)及沉默E7基因組則引起了p16ink4a基因在HCC94細(xì)

6、胞中表達(dá)的上升及在caski細(xì)胞中表達(dá)的下降。
　　為了進(jìn)一步研究p16ink4a基因?qū)ψ訉m頸鱗癌細(xì)胞系周期相關(guān)基因cyclinD1與增殖相關(guān)基因Ki67的調(diào)控，及p16ink4a基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響，我們構(gòu)建了p16ink4a基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及干擾RNA。采用脂質(zhì)體法將p16ink4a基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至子宮頸鱗癌細(xì)胞系HCC94中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、Western blotting法分別檢測(cè)兩組HCC94細(xì)

7、胞中p16ink4a、cyclinD1及Ki67基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，MTT法檢測(cè)兩組HCC94細(xì)胞增殖能力變化。將p16-siRNA及負(fù)對(duì)照siRNA經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染至子宮頸鱗癌細(xì)胞系caski中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、Western blotting法分別檢測(cè)兩組caski細(xì)胞中p16ink4a基因沉默效率及cyclinD1、Ki67基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，MTT法檢測(cè)兩組caski細(xì)胞增殖能力變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)

8、p16ink4a基因可引起cyclinD1、Ki67表達(dá)水平的升高，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈上升趨勢(shì)，沉默p16ink4a基因可引起cyclinD1、Ki67表達(dá)水平的降低，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈下降趨勢(shì)。在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中p16ink4a基因表達(dá)水平與cyclinD1及Ki67基因具有正相關(guān)性，過(guò)表達(dá)p16ink4a促進(jìn)子宮頸鱗癌細(xì)胞增殖。
　　在本課題中我們進(jìn)一步研究并闡明HPV相關(guān)性子宮頸上皮內(nèi)瘤變及鱗狀細(xì)胞癌中p16ink4a基因的異常表