周期蛋白依賴性激酶-6基因在鼻咽癌中的表達(dá)及分子功能的初步研究.pdf

1、研究目的：
　　鼻咽癌是中國(guó)南方和東南亞地區(qū)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。它的發(fā)生是一個(gè)多基因、多階段、多途徑的進(jìn)程，對(duì)鼻咽癌相關(guān)新基因的研究仍將有助于我們更好的揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)理。
　　本研究在所在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，采用基因芯片技術(shù)，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，篩選出了細(xì)胞周期依賴性激酶CDK6作為本次研究的對(duì)象，并觀察到了其細(xì)胞周期信號(hào)通路的異常表現(xiàn)。
　　基于以上研究結(jié)果，本研究為了明確CDK6在鼻咽癌中的作用，了解其參

2、與了哪些miRNA的表達(dá)和調(diào)控途徑，開(kāi)展以下研究。
　　研究?jī)?nèi)容與方法：
　　1.采用免疫組化和熒光定量等方法檢測(cè)CDK6在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2.利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法沉默CDK6基因在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)MTT、tranwell、boyden等手段研究其對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　3.對(duì)干擾CDK6表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行miRNA芯片表達(dá)譜的分析，并通過(guò)MT

3、T、tranwell、boyden、藥敏試驗(yàn)等手段對(duì)篩選出的目標(biāo)miRNA進(jìn)行功能和機(jī)制學(xué)的研究。
　　研究結(jié)果：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示，CDK6在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中，均以高表達(dá)為主，與正常鼻咽上皮組織以及細(xì)胞系相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。PCR驗(yàn)證后的結(jié)果相同。同時(shí)，有CDK6的核表達(dá)的患者的總生存率較無(wú)CDK6的核表達(dá)的患者更差。
　　2.沉默CDK6基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　

4、采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，感染HONE1和5-8F細(xì)胞，western blot驗(yàn)證其感染效率明確，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　1)采用MTT法檢測(cè)CDK6基因沉默后細(xì)胞的體外增殖情況，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖速度顯著減慢，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2)Transwell小室檢測(cè)CDK6沉默后鼻咽癌細(xì)胞體外遷徙運(yùn)動(dòng)能力的變化，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，干擾CDK6后的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱。
　　3)Boyden小室

5、檢測(cè)CDK6基因沉默后鼻咽癌細(xì)胞體外侵襲運(yùn)動(dòng)能力的改變，結(jié)果顯示干擾CDK6后，鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低。
　　3.沉默CDK6表達(dá)后，利用miRNA芯片進(jìn)行表達(dá)譜分析及機(jī)制、功能驗(yàn)證。
　　沉默CDK6表達(dá)后，利用miRNA表達(dá)譜芯片篩選出表達(dá)差異最顯著的Let-7d做為下一步研究對(duì)象。
　　1)采用Let-7d mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染后，MTT法檢測(cè)增殖情況，與空載對(duì)照組相比，Let-7d mim

6、ics組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯降低(P＜0.001)，Let-7d inhibitor組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯增快(P＜0.001)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)，相比于對(duì)照，Let-7d mimics組細(xì)胞穿膜的數(shù)量減少，Let-7d inhibitor組細(xì)胞穿膜的數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mimics t=7.572,P＜0.001,Inhibitor t=5.494,P＜0.001)。
　　3)Bo

7、yden小室侵襲實(shí)驗(yàn)，相比于對(duì)照組，Let-7d mimics組細(xì)胞穿膜數(shù)量減少，Let-7d inhibitor組細(xì)胞穿膜數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4)western blot檢測(cè)，Let-7d mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞周期基因c-myc表達(dá)下調(diào)。反之，Let-7d inhibitor組中，則c-myc表達(dá)上調(diào)。
　　5)采用MTT法對(duì)CDK6以及l(fā)et-7d表達(dá)改變導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞對(duì)(5-fu)藥物敏感性的影響進(jìn)

8、行了檢測(cè)。觀察到let-7d能夠增高NPC細(xì)胞對(duì)5-Fu的藥物敏感性。
　　研究結(jié)論:
　　1.CDK6在鼻咽癌組織中較正常鼻咽組織表達(dá)明顯上調(diào)，其核表達(dá)陽(yáng)性與患者生存率明顯相關(guān);
　　2.CDK6基因能夠增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖能力，并促進(jìn)其遷移和侵襲，對(duì)鼻咽癌的發(fā)生其正向調(diào)節(jié)作用。
　　3.CDK6可能與miRNA中的let-7d存在負(fù)相關(guān)性，并通過(guò)鼻咽癌相關(guān)蛋白c-myc調(diào)節(jié)let-7d的表達(dá)，兩者之間可能