microRNA-155對高糖致心肌纖維化的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究.pdf

1、文章分為以下部分:
　　第一部分:利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建miR-155基因敲除小鼠模型microRNAs(miRNAs)是一類小的非編碼RNAs群，其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控著相關(guān)基因的表達(dá)。microRNA-155(miR-155)是一種典型的多功能miRNA，其在機(jī)體代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。為了深入研究miR-155的功能及其特點(diǎn)，十分需要建立其相關(guān)的基因敲除模型。目前，國內(nèi)尚未見自主設(shè)計(jì)建立miR-155基因敲除小鼠

2、模型的報道。近年來，隨著基因篩查及修飾技術(shù)的革新，CRISPR/Cas9技術(shù)現(xiàn)已作為一種常用有效的技術(shù)手段應(yīng)用于基因研究中。在基因研究的動物實(shí)驗(yàn)中，基因敲除模型或者轉(zhuǎn)基因動物模型也已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)旨在利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建microRNA-155基因敲除小鼠模型，、并進(jìn)而建立純合子繁育體系。
　　目的:利用CRISPR/Cas9技術(shù)，構(gòu)建miR-155基因敲除小鼠模型。
　　方法:選擇健康C57BL/6J

3、小鼠，首先提取小鼠DNA并進(jìn)行全基因組的擴(kuò)增和測序，予以明確miR-155序列及位點(diǎn);針對miR-155的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建Cas9載體質(zhì)粒(Cas9 RNA)及打靶載體(sgRNA);隨后將體外轉(zhuǎn)錄后的Cas9mRNAs及sgRNA，顯微注射入小鼠的受精卵，并將受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng);將培養(yǎng)合格的胚胎移植到代孕小鼠的輸卵管中，待代孕小鼠生育后得到F0代小鼠;通過對F0代小鼠進(jìn)行DNA提取及基因型檢測，確定基因敲除情況，進(jìn)而建立并繁育mi

4、R-155基基因敲除小鼠模型純合子體系。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)共收集112個小鼠受精卵進(jìn)行顯微注射，發(fā)育良好形成胚胎的共94個;經(jīng)sgRNA活性檢測后，合格的胚胎共81個，隨后將其移植到5只受孕小鼠體內(nèi);5只小鼠經(jīng)21天左右分娩，共生育18只小鼠，其中1只死亡，余存活小鼠進(jìn)行DNA提取及基因型檢測分析;經(jīng)基因測序后，出現(xiàn)基因改變的小鼠共7只，其中6只小鼠只出現(xiàn)單鏈單個堿基缺失，只有4號小鼠出現(xiàn)DNA單鏈堿基片段缺失，缺失長度為114 b

5、p;對其進(jìn)行繁育后，發(fā)現(xiàn)其基因型可以穩(wěn)定傳代，得到F1代雜合子小鼠3只;雜合子小鼠回交繁育，得到F2代純合子基因敲除小鼠，并進(jìn)行基因測序驗(yàn)證:基因敲除小鼠缺失片段包含microRNA-155主基因，成功敲除miR-155基因序列。
　　結(jié)論: CRISPR/Cas9技術(shù)能夠快速、有效地構(gòu)建miR-155基因敲除小鼠模型;且miR-155基因敲除小鼠，在清潔級的動物飼養(yǎng)環(huán)境中可以正常繁育。
　　第二部分:利用基因敲除模型比較研

6、究miR-155生物學(xué)特性
　　近年來，研究發(fā)現(xiàn)miR-155參與了機(jī)體多種生物學(xué)過程，例如:免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、病毒感染、腫瘤以及心血管疾病。尤其是在炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)過程中，炎性細(xì)胞、淋巴T細(xì)胞和淋巴B細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展與miR-155的表達(dá)具有密切的聯(lián)系。既往大量研究表明miR-155具有重要的生物學(xué)功能，但是在機(jī)體正常生理?xiàng)l件下，miR-155的生物學(xué)功能及特性研究尚未見報道。前期實(shí)驗(yàn)我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功構(gòu)

7、建了miR-155基因敲除小鼠模型，并建立了純合子體系。基于前期實(shí)驗(yàn)，我們將miR-155基因敲除小鼠與正常C57BL/6野生型小鼠進(jìn)行比較研究，旨在探索正常生理?xiàng)l件下，miR-155的生物學(xué)功能及特性。
　　目的:利用基因敲除模型，比較研究miR-155生物學(xué)特性。
　　方法:隨機(jī)選取miR-155基因敲除小鼠(KO組)與正常C57BL/6野生型小鼠(WT組)，每組10只公鼠、10只母鼠，均8周齡，對其進(jìn)行比較研究，包括:

8、繁殖能力分析、生長曲線評估、腹部及心臟超聲檢查、血液學(xué)檢查以及病理組織學(xué)檢查。
　　結(jié)果:我們對通過繁殖能力、生長曲線、超聲檢查、血液學(xué)檢查以及病理組織學(xué)檢查各項(xiàng)數(shù)據(jù)整理分析發(fā)現(xiàn)，各組主要檢查指標(biāo)均沒有顯著性差異。盡管在部分?jǐn)?shù)據(jù)中出現(xiàn)了較大的差異，但在對照組與模型組組內(nèi)也呈現(xiàn)出同趨勢性變化，因此這些差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在正常的生理?xiàng)l件下，對照組及模型組小鼠的生長發(fā)育均呈正常狀態(tài)，組間無差異。通過本實(shí)驗(yàn)研究和總結(jié)近年來

9、相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)在正常生理?xiàng)l件下，miR-155是一種非必需基因，其缺失對小鼠的生長發(fā)育無明顯影響。
　　結(jié)論:小鼠出生后42天期間，miR-155基因缺失對其生長曲線無明顯影響;8周齡小鼠的正常生理?xiàng)l件下，miR-155的缺失對小鼠的生長發(fā)育無明顯影響;因此，為了研究miR-155復(fù)雜的生物學(xué)功能，必須對miR-155基因敲除小鼠進(jìn)行建模和干預(yù)。
　　第三部分:miR-155通過TGF-β信號通路調(diào)節(jié)高糖所致的心肌纖維化

10、
　　糖尿病作為臨床上最常見的疾病，常常引起多種疾病及并發(fā)癥，例如眼底病變、神經(jīng)性病變及纖維化病變。心肌纖維化是最常見的纖維化疾病之一，其也是心臟疾病中重要的病理表現(xiàn)之一。心肌纖維化可導(dǎo)致致命性的心肌損傷，例如心功能不全，甚至心臟衰竭。但是目前臨床上缺少相應(yīng)的靶向藥物可以預(yù)防或者治療心肌纖維化。既往研究表明，在心肌纖維化的進(jìn)展中，膠原的合成和沉積是導(dǎo)致纖維化加重最主要的原因之一。據(jù)報道，高糖可以加速膠原的生成，進(jìn)而加重纖維化程度，

11、從而引起心肌損傷。miR-155是一種典型的多功能miRNAs，研究發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控了多種纖維化疾病過程。但是miR-155對心肌纖維化的影響機(jī)制尚未見報道。
　　目的:探究miR-155在高糖所致心肌纖維化中的作用機(jī)制及其生物學(xué)功能。
　　方法:我們選取miR-155基因敲除小鼠(KO組)與正常C57BL/6野生型小鼠(WT組)建立高糖模型（鏈脲佐菌素腹腔注射）;建模后30天、60天行心臟超聲予以評估小鼠心功能情況;隨后進(jìn)行

12、病理組織學(xué)檢查(HE與天狼星紅染色)評估小鼠心肌損傷情況。此外，我們對正常C57BL/6野生型小鼠進(jìn)行心臟原代成纖維細(xì)胞提取并進(jìn)行miR-155的轉(zhuǎn)染(miR-155抑制、miR-155過表達(dá)及陰性對照)，進(jìn)而研究miR-155對心肌纖維化過程中的具體影響機(jī)制。
　　結(jié)果:建模30天后，所有小鼠均存活，并進(jìn)行心臟超聲檢查，結(jié)果顯示:僅正常高糖組小鼠出現(xiàn)輕微的心功能損傷，敲除高糖組未發(fā)現(xiàn)明顯心臟損傷;建模60天后，正常高糖組小鼠死亡

13、3只小鼠，敲除高糖組死亡1只小鼠，余各組均存活，所有存活小鼠均進(jìn)行心臟超聲檢查，結(jié)果顯示:糖尿病各組小鼠均出現(xiàn)顯著的心功能損傷，而且與正常高糖組相比，敲除高糖組心臟損傷程度明顯減輕。病理檢測（天狼星紅）結(jié)果顯示:對正常組相比，糖尿病組小鼠均出現(xiàn)Ⅰ型及Ⅲ型膠原的顯著增多;與敲除高糖組相比，正常高糖組細(xì)胞及組織間隙的膠原沉積程度明顯加重。另外，HE染色結(jié)果顯示:與敲除高糖組相比，正常高糖組心肌組織出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)損傷。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)高糖

14、刺激后，與正常低糖組相比，正常高糖組出現(xiàn)明顯Ⅰ型膠原的高表達(dá)。miR-155過表達(dá)高糖組Ⅰ型膠原的表達(dá)量最高。同時，與正常高糖組相比，miR-155抑制高糖組Ⅰ型膠原的表達(dá)出現(xiàn)顯著的降低;另外，與正常組相比，TGF-β1、Smad2以及磷酸化的Smad2均在miR-155抑制時出現(xiàn)顯著的下調(diào)，在miR-155過表達(dá)時出現(xiàn)了顯著的上升。
　　結(jié)論:miR-155基因敲除后可以延緩高糖導(dǎo)致的心肌纖維化，并且miR-155可以通過TGF