P65在持續(xù)性術(shù)后痛中的作用.pdf

1、背景與目的
　　持續(xù)性術(shù)后痛是發(fā)生在一些常見的外科手術(shù)比如開胸術(shù)，腹股溝疝修補(bǔ)術(shù)，剖宮產(chǎn)術(shù)等手術(shù)后，發(fā)生率為4-13％，持續(xù)時(shí)間在3-30個(gè)月不等。持續(xù)性術(shù)后痛是一個(gè)重要的臨床問題，嚴(yán)重降低了病人的生活質(zhì)量，其發(fā)生機(jī)制還不明確。目前，離子通道受體在疼痛中的作用越來越受到重視，比如鉀離子通道受體、鈉離子通道受體等。鈉離子受體的其中一個(gè)亞型Nav1.7主要表達(dá)在周圍神經(jīng)系統(tǒng)脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中，負(fù)責(zé)傷害性信號(hào)的傳入，參與了多種類型的

2、疼痛通路進(jìn)程，但是在持續(xù)性術(shù)后痛中的作用機(jī)制不清楚。NF-κB是表達(dá)在多種類型的細(xì)胞中的重要的核轉(zhuǎn)錄因子，活化后的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)通過與目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合參與多種基因的調(diào)控，p65是 NF-κB的一個(gè)常見的亞型,并且在疼痛的發(fā)生發(fā)展中參與了對(duì)多種炎癥介質(zhì)的調(diào)控。本研究旨在探討p65,Nav1.7在持續(xù)性術(shù)后痛中的作用，以及在持續(xù)性術(shù)后痛模型中p65是否參與對(duì)Nav1.7的調(diào)控。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　首先，我們通過We

3、stern blot和免疫熒光染色檢測(cè)了模型大鼠同側(cè)L4-6 DRG中Nav1.7和p-p65（p65磷酸化）的表達(dá)，然后鞘內(nèi)注射ProTx-II（Nav1.7阻斷劑）或PDTC（p65抑制劑），檢測(cè)Nav1.7蛋白的表達(dá)和機(jī)械撤足閾值的變化，最后使用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)p-p65是否可以與Nav1.7基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。通過GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1 SMIR（皮膚肌

4、肉切口牽拉）模型誘導(dǎo)了大鼠術(shù)側(cè)足底的機(jī)械性痛覺過敏
　　incision組和naive組相比，機(jī)械撤足閾值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與incision組相比，SMIR組術(shù)側(cè)的機(jī)械撤足閾值在術(shù)后5天開始下降，直到術(shù)后20天；而對(duì)側(cè)的機(jī)械撤足閾值，SMIR組和incision組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三組之間的熱縮足潛伏期沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2 DRG（脊髓背根神經(jīng)節(jié)）中的 Nav1.7參與了 SMIR模型介導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏
　　W

5、estern blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與術(shù)前大鼠相比，術(shù)后10天，15天，20天，大鼠術(shù)側(cè)L4-6 DRG Nav1.7的表達(dá)量明顯增高。為了確認(rèn)是否上調(diào)的Nav1.7在SMIR介導(dǎo)的痛覺過敏中起作用，我們通過鞘內(nèi)注射Nav1.7阻斷劑ProTx-II，發(fā)現(xiàn)ProTx-II可以有效的緩解SMIR模型介導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏。
　　3 Nav1.7主要表達(dá)在CGRP、IB4、NF-200標(biāo)記的陽性細(xì)胞上
　　為了確認(rèn) Nav1.7在

6、 DRG神經(jīng)元中的表達(dá)類型，我們使用了免疫熒光雙染的方法，發(fā)現(xiàn)Nav1.7與CGRP、IB4、NF-200標(biāo)記的細(xì)胞共標(biāo)，通過Imagej軟件分析，發(fā)現(xiàn)80%的Nav1.7陽性細(xì)胞是小直徑神經(jīng)元，17%的Nav1.7陽性細(xì)胞是中直徑神經(jīng)元，僅有3%的Nav1.7陽性細(xì)胞是大直徑神經(jīng)元。
　　4 P-p65在SMIR模型DRG中高表達(dá)
　　有研究報(bào)道，p-p65參與了神經(jīng)病理性疼痛和炎性疼痛的進(jìn)程。本研究中我們檢測(cè)了DRG中p

7、-p65在SMIR模型介導(dǎo)的持續(xù)性術(shù)后痛中的作用。我們發(fā)現(xiàn)PDTC可以阻止 SMIR模型大鼠的機(jī)械性痛覺過敏。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與incision組相比，SMIR模型大鼠術(shù)側(cè)L4-6 DRG中的核蛋白p-p65在術(shù)后10天、15天高表達(dá)，而PDTC預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)p-p65的高表達(dá)。
　　5 P-p65通過上調(diào)大鼠DRG中Nav1.7的表達(dá)參與了SMIR模型介導(dǎo)的持續(xù)性術(shù)后痛
　　我們知道，p65是一種很重要的核

8、轉(zhuǎn)錄因子，參與了多種目的基因的轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步驗(yàn)證p-p65是否在持續(xù)性術(shù)后痛中參與了對(duì)Nav1.7的調(diào)控，我們通過鞘內(nèi)注射PDTC來檢測(cè)Nav1.7的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，在術(shù)后10天和15天， PDTC可以阻止Nav1.7的上調(diào)。接著我們做了免疫熒光雙染，發(fā)現(xiàn)p-p65與CGRP, NF-200和 IB-4共表達(dá)。免疫共沉淀結(jié)果顯示，p-p65在引物2,7,8,9可以與SCN9A基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。
　　結(jié)論
　　p-p65