不同基底硬度在調(diào)控HepaRG細胞分化為肝細胞樣細胞中的作用.pdf

1、背景及目的:急性肝衰竭(ALF)是因肝細胞大量壞死至肝功能嚴重不足而引起的一系列臨床癥狀的綜合征，病死率高。肝移植仍是目前治療急性肝衰竭最主要的手段，然而因供體器官短缺、免疫排斥、費用昂貴等原因，肝移植仍不能被廣泛運用到臨床上。這使得發(fā)展生物人工肝(BAL)，延長急性肝衰竭患者的生存期，提高他們的生存狀態(tài)，引起人們高度重視。而如何獲取大量可利用肝細胞一直以來被認為是發(fā)展生物人工肝的難題。HepaRG細胞是在2002年首次分離出來的肝祖細

2、胞系，HepaRG細胞在二甲基亞砜(DMSO)誘導(dǎo)下可分化為有功能的肝細胞樣和膽管細胞樣細胞，分化后的細胞適用于BAL、人肝細胞模型、研究病毒性肝炎機制等，但DMSO也會抑制分化后的細胞表達ALB、細胞色素P450、氨的消除、細胞增生等特殊肝功能，這促使我們?nèi)ふ腋行У恼T導(dǎo)HepaRG細胞分化的方法。而近年來有國外研究發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)(ECM)可以調(diào)控細胞生物學行為比如細胞遷移、增生、分化等。本研究立足以此，通過構(gòu)建基底彈性梯度ECM系

3、統(tǒng)來誘導(dǎo)HepaRG細胞分化，初步探索基底硬度調(diào)控HepaRG細胞快速分化為肝細胞樣細胞的可行性，為BAL提供新的肝細胞來源。
　　方法:
　　1、構(gòu)建4組不同硬度的基底（4s組、8s組、16s組、Glass組）和ALB-GFP熒光報告細胞系系統(tǒng)，HepaRG細胞分別接種于4種基底上，通過檢測細胞ALB表達和運用倒置顯微鏡觀察HepaRG細胞分化前后的形態(tài)變化，來鑒定各組HepaRG細胞分化效果;
　　2、阿爾瑪藍(A

4、lamarbule)檢測各組細胞增殖情況;
　　3、免疫熒光染色檢測各組細胞力學響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(YAP)的表達，初步探查軟的基底誘導(dǎo)HepaRG細胞分化原因。
　　結(jié)果:
　　1、ALB-GFP熒光報告細胞系系統(tǒng)及運用Image J軟件對ALB表達分析結(jié)果顯示:在第4h，4s組分別與8s組、16s組、Glass組HepaRG細胞中ALB的表達量比較，差異沒有統(tǒng)計學顯著性;在第4d，4組HepaRG細胞中ALB的表達量互相

5、比較，差異有統(tǒng)計學顯著性，4s組ALB的表達量高于16s組和Glass組，差異均有統(tǒng)計學顯著性，4s組與8s組比較，差異沒有統(tǒng)計學顯著性;在第7d，4組HepaRG細胞中ALB的表達量互相比較，差異均有統(tǒng)計學顯著性，4s組分別和8s組、16s組、Glass組比較，其ALB的表達量較高，差異均有統(tǒng)計學顯著性。
　　2、倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示:在誘導(dǎo)分化第0天(4h)，HepaRG細胞形態(tài)呈現(xiàn)一致的瘦長形細胞，隨著培養(yǎng)時間延長，Hep

6、aRG細胞從第4天達到匯合后開始出現(xiàn)分化;在第7天，HepaRG細胞基本分化為兩種形狀不同的細胞，一種呈現(xiàn)肝細胞樣顆粒狀上皮細胞，有1至2個細胞核，另一種圍繞著第一種細胞，呈現(xiàn)扁平狀，有清晰的細胞質(zhì)，肝細胞樣細胞約占總細胞數(shù)50-55％。
　　3、Alamar bule檢測結(jié)果顯示:在第4d，4s組的細胞總數(shù)分別和8s組、16s組、Glass組比較，差異均無統(tǒng)計學顯著性;在第7d，4s組的細胞總數(shù)分別和8s組、16s組、Glass

7、組比較，差異仍無統(tǒng)計學顯著性。
　　4、免疫熒光染色檢測YAP結(jié)果顯示:最軟基底上的YAP主要定位在細胞質(zhì)里，中間硬度基底上的YAP在細胞質(zhì)和細胞核里都有定位，最硬基底上的YAP主要定位在細胞核里。
　　結(jié)論:
　　1、軟的基底更有利于肝祖細胞系HepaRG細胞快速向肝細胞樣細胞分化。
　　2、軟的基底在誘導(dǎo)HepaRG細胞分化時不影響細胞增殖活性，HepaRG細胞有望為生物人工肝提供所需的肝細胞。
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