志賀菌中插入序列IS600的插入特點(diǎn)及其對(duì)cse2基因和Cas蛋白影響的生物信息學(xué)分析.pdf

1、志賀菌屬通稱痢疾桿菌，是感染性腹瀉的常見致病菌之一，可引起細(xì)菌性痢疾。隨著各類抗生素在臨床的長(zhǎng)期和廣泛使用,志賀氏菌的耐藥問題日益嚴(yán)重。耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer,HGT）是大多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性尤其是多重耐藥性的主要方式之一。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat

2、s,CRISPRs），連同CRISPR相關(guān)基因（Cas）及其編碼的Cas蛋白共同組成CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)，它廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中，提供抵御質(zhì)粒和噬菌體等外來入侵遺傳元件的獲得性免疫，具有限制外源性遺傳物質(zhì)水平轉(zhuǎn)移的作用。插入序列(insertion sequence，IS)是染色體的特殊組成部分，是最簡(jiǎn)單的高度可移動(dòng)性轉(zhuǎn)座因子，可攜帶耐藥基因轉(zhuǎn)移，其在基因組中的插入可能使細(xì)菌基因產(chǎn)生突變從而影響細(xì)菌基因的正常表達(dá)。

3、r>　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)志賀菌Cas蛋白基因cse2中存在插入序列IS600，且插入序列IS600可使cse2 mRNA的表達(dá)水平降低，推測(cè)IS插入cas基因可能會(huì)影響Cas蛋白的功能進(jìn)而影響Cascade蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能。為進(jìn)一步研究插入序列對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的影響，結(jié)合課題組前期工作，本研究欲通過對(duì)cse2基因的生物信息學(xué)分析探索插入序列IS600對(duì)Cas蛋白及整個(gè)CRISPR/Cas系統(tǒng)

4、的影響，進(jìn)而為解決志賀菌的耐藥問題提供新思路。
　　目的：
　　了解志賀菌中插入序列IS600在cse2基因中的的插入特點(diǎn)，分析其對(duì)cse2基因和Cse2蛋白的影響，并對(duì)cse2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　方法：
　　1.利用實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增志賀菌株的CRISPR相關(guān)蛋白基因cse2并將瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果陽(yáng)性條帶樣品送測(cè)序。
　　2.應(yīng)用Clustal X軟件和Blast在線比對(duì)（Globa

5、l Align）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。
　　3.應(yīng)用ORF Finder和ExPASy的Translate tool翻譯并在線查找開放閱讀框。
　　4.應(yīng)用ProtParam工具和compute工具（計(jì)算等電點(diǎn)和分子量）在線分析蛋白理化性質(zhì)；應(yīng)用ProtScale軟件分析親水性、疏水性。
　　5.應(yīng)用TMHMM Server v.2.0進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；應(yīng)用Pfam31.0程序和CDD軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。
　　6.應(yīng)

6、用PredictProtein、SOPMA和PSIPRED進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。
　　7.應(yīng)用SWISS-MODEL和PDBsum Generate分別進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和預(yù)測(cè)模型的在線評(píng)估。
　　結(jié)果：
　　1.39株志賀菌中，有2株細(xì)菌未檢出cse2基因，有12株細(xì)菌cse2基因條帶大小約為400bp，有25株細(xì)菌cse2基因條帶大小約為1600bp；基因擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與GenBank中宋內(nèi)志賀菌Ss046比對(duì)表

7、明為目的基因cse2，且增加的1200bp通過測(cè)序確定為插入序列IS600的開放閱讀框序列。
　　2.插入序列IS600插入cse2基因位置從第263個(gè)堿基開始，位于cse2基因的后半部分，插入序列IS600插入cse2基因的熱點(diǎn)為堿基TGC-GGC。
　　3.菌株Ss046和菌株53G的cse2基因預(yù)測(cè)的開放閱讀框不同，連續(xù)翻譯的氨基酸序列不同，編碼的蛋白質(zhì)不同。
　　4.菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白的理

8、化性質(zhì)如等電點(diǎn)和分子量、脂溶指數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、親水性和疏水性、氨基酸組成分布等都不相同。
　　5.菌株Ss046和菌株53G兩者的Cse2蛋白整條肽鏈都位于細(xì)胞膜之外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)，不是跨膜蛋白；菌株 Ss046的 Cse2蛋白具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：HTH21(HTH-like domain)和rev(Integrase core domain)，前者即HTH結(jié)構(gòu)域，后者即整合酶核心領(lǐng)域；菌株53G的Cse2蛋白具有一個(gè)結(jié)構(gòu)域：CRI

9、SPR Cse2。
　　6.結(jié)合三種方法對(duì)菌株Ss046和菌株53G的Cse2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果可知：α-螺旋和β-折疊散布于整個(gè)Cse2蛋白，成為蛋白的剛性支撐，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例也較高，間雜少量的β-轉(zhuǎn)角。但兩菌株Cse2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)成分的比例都不同。
　　7.Cse2蛋白三維同源結(jié)構(gòu)建模顯示該蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。從構(gòu)建的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型結(jié)果來看，菌株Ss046和菌株53G的