KrasG12D突變介導(dǎo)胰腺FGF21表達降低調(diào)控胰腺癌發(fā)生的機制研究.pdf

1、第一部分 FGF21及其相關(guān)受體在胰腺組織中的表達分布研究
　　目的:研究FGF21及其相關(guān)受體FGFR1和KLB在胰腺組織中的表達分布規(guī)律，并探索FGF21在正常胰腺與胰腺癌中的表達情況。
　　方法:通過qRT-PCR、Western Blot以及免疫組織化學(xué)染色方法檢測對比正常70天齡小鼠的胰腺組織和肝臟組織的FGF21表達情況;通過qRT-PCR和半定量PCR檢測正常70天齡小鼠的胰腺組織和肝臟組織的FGFR1表達情況

2、;通過qRT-PCR、Western Blot以及免疫組織化學(xué)染色方法檢測對比正常70天齡小鼠的胰腺組織和肝臟組織的KLB表達情況;通3過qRT-PCR檢測7月齡老年小鼠的胰腺和肝臟組織中FGF21、FGFR1和KLB三種基因的表達情況;通過免疫組織化學(xué)染色明確成人胰腺癌組織與正常胰腺組織的FGF21表達差異，再通過qRT-PCR比較正常胰腺細胞和含有Kras突變的人胰腺癌細胞系中FGF21的表達差異。
　　結(jié)果:qRT-PCR、

3、Western Blot以及免疫組織化學(xué)染色(IHC)結(jié)果均顯示正常70天齡小鼠胰腺組織中存在FGF21表達并且表達量顯著高于肝臟組織(p＜0.05)，其中qRT-PCR顯示胰腺組織中FGF21的表達量是肝臟組織的約80倍。免疫組織化學(xué)染色確認了FGF21在胰腺中高表達。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺中FGF21蛋白水平高于肝臟。半定量PCR檢測FGFR1的結(jié)果顯示正常70天齡小鼠胰腺組織中FGFR1的表達明顯高于肝臟組織中的FG

4、FR1表達量，而qRT-PCR結(jié)果顯示FGFR1基因在胰腺組織中表達量是肝臟組織的約12倍(p＜0.05)。Western Blot結(jié)果顯示KLB在正常70天齡小鼠胰腺組織表達，通過qRT-PCR方法與肝臟組織比較后發(fā)現(xiàn)KLB在肝臟和胰腺組織表達量未見明顯差異(p＞0.05)，而免疫組織化學(xué)染色結(jié)果直觀的證實了KLB在胰腺組織中表達，并且主要存在與腺泡而非胰島細胞。通過qRT-PCR檢測7月齡老年小鼠的胰腺和肝臟組織中FGF21、FGF

5、R1和KLB三種基因的表達的結(jié)果顯示FGF21在胰腺組織中的表達量顯著高于肝臟組織(p＜0.05)，約是在肝臟組織中的60倍;FGFR1在胰腺組織中的表達量顯著高于肝臟組織(p＜0.05)，約是在肝臟組織中的12倍;KLB在胰腺組織和肝臟組織中表達量未見明顯差異(p＞0.05)。為檢測FGF21在胰腺癌中的表達水平，我們對人胰腺組織芯片進行了免疫組織化學(xué)染色，比較胰腺導(dǎo)管腺癌和正常胰腺組織中FGF21的水平。通過對正常人胰腺組織45份和

6、胰腺導(dǎo)管腺癌組織59份標(biāo)本進行FGF21免疫組織化學(xué)染色并評分結(jié)果顯示FGF21在胰腺癌組織中表達量顯著降低(p＜0.05)，通過qRT-PCR比較正常胰腺細胞與多種胰腺癌細胞中FGF21表達結(jié)果證實胰腺癌細胞中FGF21基因表達與正常胰腺細胞相比顯著降低(p＜0.05)。
　　結(jié)論:FGF21及其受體FGFR1以及共受體KLB在正常胰腺組織中均有表達，且FGF21以及FGFR1在胰腺組織中的表達量顯著高于肝臟組織中的表達。且KL

7、B主要分布與胰腺腺泡細胞而非胰島細胞，以上結(jié)果提示FGF21在小鼠胰腺組織中主要在其外分泌過程中發(fā)揮作用。另外通過對老年小鼠的研究結(jié)果顯示結(jié)果與成年小鼠結(jié)果一致提示年齡因素對FGF21及其受體影響不大。胰腺癌組織和細胞的研究結(jié)果表明FGF21在正常胰腺組織和胰腺癌組織明顯差異性表達，F(xiàn)GF21在胰腺癌中程顯著低表達。
　　第二部分 KrasG12D/+介導(dǎo)胰腺FGF21低表達的機制研究
　　目的:明確KrasG12D基因突變

8、小鼠FGF21低表達的可能機制。
　　方法:通過qRT-PCR以及FGF21免疫組織化學(xué)染色比較FGF21在正常胰腺組織和KrasG12D/+小鼠胰腺組織中的表達情況，再通過qRT-PCR研究KrasG12D突變早期FGF21、FGFR1和KLB的變化情況;通過qRT-PCR研究MIST1在KrasG12D+誘導(dǎo)表達后1周、1月、5月時的胰腺組織中表達情況。然后通過qRT-PCR研究KrasG12D/+小鼠與正常小鼠EZH2的表達

9、情況，并且通過沉默KrasG12D+小鼠的EZH2基因采用qRT-PCR明確FGF21、MIST1的表達與EZH2表達的相關(guān)性;再使用EZH2抑制劑(DZNep)處理PANC1胰腺癌細胞后通過qRT-PCR以及半定量PCR研究EZH2抑制后胰腺癌細胞中FGF21的表達變化。最終明確KrasG12D/+、MIST1、EZH2等參與胰腺癌組織中FGF21低表達過程中的重要機制作用。
　　結(jié)果:首先是qRT-PCR提示FGF21在Kra

10、sG12D+誘導(dǎo)表達5月后的小鼠胰腺組織中顯著低表達，而FGF21的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果證實了這一結(jié)果，也顯示KrasG12D基因突變后FGF21表達顯著降低;KrasG12D+表達早期（一周）時的qRT-PCR分析結(jié)果顯示FGF21在突變早期表達就顯著降低，而FGFR1與KLB則未見明顯變化。而對KrasG12D+誘導(dǎo)表達后不同時間段MIST1的基因表達研究表明MIST1也在突變早期表達就顯著降低，并且隨著KrasG12D表達時間的增

11、加，MIST1的表達也逐漸降低，直到KrasG12D+誘導(dǎo)表達5月后小鼠胰腺組織中MIST1的表達幾乎消失，隨后Western Blot也證實KrasG12D表達后MIST1蛋白表達量降低。對EZH2的qRT-PCR研究結(jié)果顯示其在KrasG12D突變小鼠胰腺組織中的表達結(jié)果顯著高于正常對照。而再次比較正常小鼠、KR-EZH2（KrasG12D/+小鼠沉默EZH2基因）、KrasG12D/+小鼠三組胰腺組織中FGF21以及MIST1的表

12、達結(jié)果顯示KR-EZH2組中FGF21以及MIST1的表達量雖顯著低于正常對照組，但卻顯著高于KrasG12D/+組。而DZNep處理PANC1胰腺細胞后細胞中FGF21基因表達量顯著升高，半定量PCR也顯示FGF21的表達水平與DZNep加入的濃度成正相關(guān)。
　　結(jié)論:KrasG12D基因突變可早期顯著降低FGF21在胰腺組織中的表達，同時早期降低的還有FGF21的上游基因MIST1，其在KrasG12D基因突變后變化趨勢與FG

13、F21一致，表明KrasG12D突變后通過MIST1下調(diào)FGF21水平。而EZH2在KrasG12D/+小鼠胰腺組織中高表達，且在KrasG12D/+小鼠中沉默EZH2后胰腺中的FGF21與MIST1的表達量明顯回升，表明EZH2是KrasG12D突變導(dǎo)致FGF21降低的關(guān)鍵;而通過EZH2抑制劑(DZNep)處理胰腺癌細胞導(dǎo)致FGF21高表達的結(jié)果再次驗證了EZH2也是胰腺癌中FGF21低表達的關(guān)鍵因子;因此綜上表明胰腺癌中FGF21

14、的顯著低表達是KrasG12D位點突變導(dǎo)致EZH2表達顯著升高、MIST1表達顯著降低最終導(dǎo)致FGF21的表達降低。
　　第三部分外源性FGF21治療對KrasG12D/+小鼠在高脂飲食誘導(dǎo)下胰腺癌的發(fā)生療效的動物實驗研究
　　目的:通過動物實驗驗證外源性補充FGF21治療KrasG12D/+小鼠高脂飲食誘導(dǎo)胰腺癌易感性的療效，驗證KrasG12D/+小鼠在高脂飲食誘發(fā)下胰腺癌的高發(fā)的原因是由于FGF21降低造成的，最終明確

15、外源性補充FGF21能夠抑制KrasG12D突變情況下高脂飲食誘導(dǎo)的胰腺癌發(fā)生。
　　方法:首先設(shè)立四個小組:Bac小鼠+ND（正常飲食）正常對照組，KrasG12D/+小鼠+ND（正常飲食）組，KrasG12 D/+小鼠+HFD（高脂飲食）組，KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂飲食）+rhFGF21組。每組取10周大的小鼠8只，在他莫昔芬誘導(dǎo)KrasG12D表達后一周，開始給予不同飲食和FGF21處理。在小鼠5月齡大時處死，

16、取各組小鼠胰腺標(biāo)本進行制備病理切片H&E染色觀察統(tǒng)計胰腺癌變發(fā)生率，并檢測小鼠胰腺組織中TG、α-SMA和Amylase的表達情況，再通過Sirius Red染色、CK19、Cox-2、F4/80、CD3、Cyclin D1、Ki-67等免疫組織化學(xué)染色觀察各組小鼠胰腺組織具體結(jié)構(gòu)變化、炎性改變、免疫細胞浸潤、細胞增殖等現(xiàn)象，并進行對比。另外再設(shè)立繼續(xù)按照4種分組隨訪，記錄各組小鼠的食物攝入情況以及體重變化情況，繪制變化曲線，各組間進行

17、比較。以各組小鼠死亡為觀察終點，繪制各組小鼠生存曲線。
　　結(jié)果:在5月齡處死組中，HFD+ KrasG12D/+小鼠組胰腺組織顯著肥大異常，而rhFGF21+HFD+ KrasG12D/+小鼠組，和ND飼養(yǎng)組大體觀均未見顯著異常。H&E結(jié)果顯示HFD+ KrasG12D/+小鼠組中5/8的小鼠病理發(fā)現(xiàn)診斷PDAC，而rhFGF21+HFD+KrasG12D/+小鼠組為1/8，另外兩組ND飼養(yǎng)組均未見惡變病例。另發(fā)現(xiàn)TG、α-SM

18、A在HFD+ KrasG12D/+小鼠組顯著升高，Amylase在HFD+ KrasG12D/+小鼠組表達量顯著降低。Sirius Red染色、CK19、Cox-2、F4/80、CD3、Cyclin D1、Ki-67等免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示HFD+ KrasG12D/+小鼠組胰腺組織陽性染色顯著增加。
　　另外隨訪結(jié)果顯示KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂飲食）組和KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂飲食）+rhFGF21

19、攝入食物量少于BAC小鼠+ND（正常飲食）正常對照組，KrasG12D/+小鼠+ND（正常飲食）組，KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂飲食）組和KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂飲食）+rhFGF21食物攝取量沒有差異。每組雄性小鼠食物攝取量大于較雌性小鼠。長期隨訪結(jié)果顯示外源性FGF21治療可推遲KrasG12D/+小鼠在高脂飲食情況下胰腺癌的發(fā)生時間，顯著延長高脂飲食下作用下的KrasG12D/+小鼠生存時間。
　　結(jié)