生、熟大黃“生瀉熟緩、生熟異治”炮制機(jī)理研究.pdf

1、中藥炮制技術(shù)是我國獨(dú)特的傳統(tǒng)制藥技術(shù)，大黃是臨床“生熟異用”的典型。本論文緊緊圍繞炮制改變大黃藥性，即“生瀉熟緩、生熟異治”,采用UHPLC-Q-TOFMS技術(shù)結(jié)合譜效關(guān)系，探討生大黃炮制為熟大黃后的化學(xué)成分變化，確定與藥效差異相關(guān)的有效成分；以大黃炮制前后“生瀉熟緩”的功效變化為切入點(diǎn),建立了符合中醫(yī)“標(biāo)本兼治”特色的“熱結(jié)便秘”模型，以大承氣湯為載體研究生、熟大黃對(duì)模型大鼠排便情況、胃腸激素和腸神經(jīng)遞質(zhì)、水通道蛋白、H22荷瘤小鼠腫

2、瘤生長等的影響，從方劑角度闡明了生、熟大黃“生瀉熟緩、生熟異治”的合理性和正確性。
　　目的：
　　本課題對(duì)生、熟大黃“生瀉熟緩、生熟異治”的炮制機(jī)理進(jìn)行研究，UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)與譜效關(guān)系相結(jié)合，確定能體現(xiàn)“生熟異治”功效變化的生、熟大黃的特征成分；建立“熱結(jié)便秘”的病癥模型對(duì)生、熟大黃“生瀉熟緩”的炮制功效進(jìn)行評(píng)價(jià)，并按照中醫(yī)標(biāo)本兼治的用藥原則，探討“生瀉熟緩”的炮制機(jī)理；通過探討生、熟大黃對(duì)于HEPG2、M

3、G-63、B16、HELA細(xì)胞體外的抗腫瘤活性和生、熟大黃對(duì)H22荷瘤小鼠的抑腫瘤作用及對(duì)免疫器官的影響，探討“生熟異治”的炮制機(jī)理，為臨床合理使用炮制品的更合理使用提供依據(jù)。
　　方法：
　　采用文獻(xiàn)學(xué)、藥理學(xué)、化學(xué)相結(jié)合的手段，開展生、熟大黃“生瀉熟緩、生瀉熟補(bǔ)、生熟異治”的炮制機(jī)理研究。
　　1、UHPLC-Q-TOF MS技術(shù)與譜效關(guān)系聯(lián)用，指認(rèn)生、熟大黃藥效差異的標(biāo)志性成分。
　　2、采用藥理學(xué)方法，建

4、立能體現(xiàn)中醫(yī)病證特點(diǎn)的熱結(jié)便秘模型，探討生、熟大黃單用和在復(fù)方中的作用差異。
　　3、應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)不同濃度生、熟大黃提取物（0、2.5、5、10、20、40、80?g/ml）對(duì)HEPG2、MG-63、B16、HELA細(xì)胞增殖抑制作用，計(jì)算生、熟大黃及其乙醇提取物對(duì)細(xì)胞生長的抑制率。
　　4、采用腹水型肝癌細(xì)胞株建立小鼠移植腫瘤模型，觀察生、熟大黃對(duì)小鼠的一般狀態(tài)，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、抑瘤率、小鼠的生命延長率的影響。<

5、br>　　5、以熱結(jié)便秘模型為基礎(chǔ)，從排便指數(shù)、胃腸激素、腸神經(jīng)遞質(zhì)的變化等方面探討生、熟大黃的作用差異。
　　6、從水通道蛋白AQP2、AQP3、AQP4的基因表達(dá)變化結(jié)合“VIP-PKA-CAMP-AQP3”信號(hào)通路研究“生瀉熟緩”炮制機(jī)制。
　　7、本研究采用灰關(guān)聯(lián)度分析將大黃“瀉下”與“活血化瘀”作用的幾個(gè)藥效學(xué)指標(biāo)：瀉下指數(shù)、AQP3、ET-1等與所建立的特征圖譜關(guān)聯(lián)起來，找出特征圖譜和藥效指標(biāo)之間的聯(lián)系,建立譜-

6、效關(guān)系,揭示大黃藥效的變化與內(nèi)在化學(xué)成分變化的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.排便實(shí)驗(yàn)和瀉下指數(shù)測(cè)定顯示，對(duì)正常小鼠和熱結(jié)便秘模型小鼠，生大黃與其復(fù)方大承氣湯各劑量組EI明顯增高，熟大黃及其復(fù)方大承氣湯各劑量組EI變化不顯著，生大黃瀉下作用明顯強(qiáng)于熟大黃（P<0.05)，從單味藥到復(fù)方都說明生瀉熟緩。
　　2.胃腸激素-神經(jīng)遞質(zhì)-腦腸肽系統(tǒng)：生大黃組與熟大黃組比較，血清GAS、MTL、VIP、NT、SS、AchE、SP、

7、ET-1的含量和結(jié)腸GAS、MTL、VIP、NT的含量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)。生大黃能夠抑制結(jié)腸VIP的釋放，升高血清MTL、NT、SS、SP、AchE及結(jié)腸MTL、NT的水平，增加結(jié)腸動(dòng)力，促進(jìn)排便。
　　3.胃腸激素-神經(jīng)遞質(zhì)-腦腸肽系統(tǒng)：與大承氣湯配伍生大黃組比較，大承氣湯配伍熟大黃組GAS、MTL、VIP、NT、SS、AchE、SP、ET-1有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)。
　　4.

8、對(duì)結(jié)腸水通道蛋白表達(dá)的影響：熱結(jié)便秘模型大鼠結(jié)腸AQP2、AQP3、AQP4的表達(dá)增高；生、熟大黃治療組、大承氣湯配伍生大黃治療組、大承湯配伍熟大黃治療組均能使熱結(jié)便秘大鼠結(jié)腸AQP2、AQP3、AQP4的表達(dá)降低；生大黃治療組與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，熟大黃有降低趨勢(shì)；大承氣湯配伍生大黃治療組與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，大承湯配伍熟大黃治療組有降低趨勢(shì)。
　　5.VIP-CAMP-PKA-AQP3通路：

9、生大黃組較之模型組CAMP、PKA明顯降低(P<0.05，P<0.01)；熟大黃組較之模型組PKA明顯降低(P<0.01)；大承氣湯配伍生大黃組與模型組比較CAMP、PKA明顯降低(P<0.01)；大承氣湯配伍熟大黃組與模型組比較PKA明顯降低(P<0.01)。生大黃組與熟大黃組比較，大承氣湯配伍生大黃組與大承氣湯配伍熟大黃組比較CAMP和PKA均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與模型組比較，生大黃組大鼠結(jié)腸組織AQP3表達(dá)量顯著降低(P

10、<0.05)，其余各組大鼠結(jié)腸組織AQP3表達(dá)量有降低趨勢(shì)。
　　6.ENS-ICC-SMC：與模型組比較，陽性藥組、大承氣湯配伍生大黃組、大承氣湯配伍熟大黃組大鼠結(jié)腸組織ICC含量極顯著增多(P<0.01)，生大黃組大鼠結(jié)腸組織ICC含量顯著增多(P<0.05)；
　　與ICC相關(guān)的興奮性腸神經(jīng)遞質(zhì)AchE、SP、NT與模型組比較顯著增高(P<0.01)，而抑制性腸神經(jīng)遞質(zhì)VIP較之模型組，生大黃組和大承氣湯配伍生大黃出現(xiàn)

11、下降，后者有顯著性差異(P<0.05)。
　　7.對(duì)HEPG2、MG-63、B16、HELA的抑制：
　　生、熟大黃水提取物對(duì)于四種腫瘤細(xì)胞（HEPG2、MG-63、B16、HELA）均無抑制作用；生大黃乙醇提取物對(duì)于肝癌細(xì)胞HEPG2、宮頸癌細(xì)胞HELA有一定的抑制作用，對(duì)于MG-63、B16無抑制作用；熟大黃乙醇提取物對(duì)肝癌細(xì)胞HEPG2和宮頸癌細(xì)胞HELA的作用比較明顯，當(dāng)試藥濃度為100μg/ml時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制

12、率達(dá)到50％以上，而對(duì)MG-63、B16作用較弱或無抑制作用。
　　大黃酸葡萄糖苷(RHG)對(duì)子宮頸癌細(xì)胞HELA增殖有一定的抑制作用，大黃素葡萄糖苷(EMG)和大黃素甲醚葡萄糖苷(PHG）幾無作用；RHG對(duì)肝癌HEPG2增殖有較強(qiáng)的抑制作用，EMG有一定的抑制作用，PHG幾無作用；RHG和EMG對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG-63有一定的抑制作用，PHG幾無作用；對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16，三種化合物幾無作用。
　　8.H22荷瘤小鼠：

13、>　　小鼠的平均抑瘤率，與模型組比較，熟大黃高、中、低劑量組、生大黃高劑量組、替加氟組小鼠的平均瘤重具有顯著差異（p<0.01，p<0.05）。生大黃中劑量組和低劑量組的平均瘤重與模型組比較無顯著差異（p>0.05）。
　　熟大黃高、中、低劑量組以及生大黃低劑量組的胸腺指數(shù)與模型組比較均有顯著差異（p<0.01，p<0.05）。生大黃中、低劑量組、陽性藥組與模型組比較無顯著性差異（p>0.05）。模型組、陽性藥組、生大黃高、中低劑

14、量組的脾臟指數(shù)與空白組比較具有極顯著差異（p<0.01），熟大黃高、中、低劑量組的脾臟指數(shù)與空白組比較無顯著差異（p>0.05）。
　　小鼠生存時(shí)間，熟大黃高、中、低劑量組與模型組比較有極顯著差異（p<0.01）。替加氟組及生大黃高、中、低劑量組小鼠生存時(shí)間與模型組比較無顯著差異（p>0.05）；熟大黃各劑量組小鼠生存時(shí)間與替加氟組比較有顯著差異（p<0.05），生大黃各組與熟大黃各組比較小鼠生存時(shí)間有顯著差異。
　　9.采

15、用UHPLC/Q-TOF MS技術(shù)對(duì)生、熟大黃的化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，本實(shí)驗(yàn)在大黃中檢測(cè)到50余種成分，初步鑒定了46種成分，其中蒽醌類化合物28種，二苯乙烯苷類化合物3種，丁酮類1種，鞣質(zhì)類化合物3種，黃酮類化合物2種，其他化合物9種。
　　10.采用UHPLC/Q-TOF MS技術(shù)建立了生、熟大黃的特征圖譜。
　　11.譜效關(guān)系研究結(jié)果：
　　“瀉下指數(shù)”關(guān)聯(lián)度大于0.70的物質(zhì)按關(guān)聯(lián)系數(shù)從大到小的順序：physci

16、on-8-O-β-D-glucopyranoside>sennosideB>emodin-1-O-β-D-glucopyrano side>torachrysone-8-O-β-D-glucopyranoside>emodin>(-)epicatechin-3-O-gallate；
　　“AQP3表達(dá)變化”關(guān)聯(lián)度大于0.70的物質(zhì)按關(guān)聯(lián)系數(shù)從大到小 gallic acid>aloe-emodin-3-CH2-O-β-D-gluco

17、pyranoside>Torachrysone>rhein>chrysophano l>sucrose>physcion>catechin>aloe-emodin>gallic acid-4-O-β-D-glucopyranoside；
　　ET-1關(guān)聯(lián)度大于0.70的化學(xué)物質(zhì)按關(guān)聯(lián)系數(shù)從大到小排列的順序?yàn)椋簆hyscion-8-O-β-D-glucopyranoside>emodin-1-O-β-D-glucopyranosid

18、e>sennoside B>torachrysone-8-O-β-D-glucopyranoside>emodin>(-)epicatechin-3-O-gallate。
　　結(jié)論：
　　1.采用病證結(jié)合模型對(duì)生、熟大黃的瀉下作用差異進(jìn)行了研究，表明：生大黃瀉下指數(shù)（EI）高于熟大黃；生、熟大黃在復(fù)方中的配伍實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大承氣湯配伍生大黃的瀉下作用明顯強(qiáng)于大承氣湯配伍熟大黃，從單味藥到復(fù)方證明了大黃“生瀉熟緩”炮制理論的正確性

19、。
　　2.以胃腸激素-神經(jīng)遞質(zhì)-腦腸肽，水通道蛋白表達(dá)，VIP-CAMP-PKA-AQP3通路，ENS-ICC-SMC為切入點(diǎn)對(duì)“生瀉熟緩”炮制機(jī)制進(jìn)行了研究，從多角度闡明了大黃的炮制機(jī)制。
　　3.從整體到組分的體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明：熟大黃的抗腫瘤活性強(qiáng)于生大黃，從而證明了炮制確能增強(qiáng)大黃的活血化瘀作用。
　　4.譜效關(guān)系研究，找出了生、熟大黃藥效差異與以下幾個(gè)化合物密切相關(guān)：Physcion-8-O-β-D-gl

20、ucopyranoside（大黃素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）
　　Sennoside B（番瀉苷B）
　　Gallic acid（沒食子酸）
　　Catechin（兒茶素）
　　Physcion（大黃素甲醚）
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.采用病證結(jié)合模型，從單味藥到復(fù)方，以復(fù)方為載體進(jìn)行炮制機(jī)理研究，充分體現(xiàn)了中醫(yī)“標(biāo)本兼治”的用藥特點(diǎn)。
　　2.采用多指標(biāo)、多通路，研究大黃“生瀉熟緩”炮制