TNFAIP8與LATS1相互作用抑制Hippo通路而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲.pdf

1、目的:肺癌作為世界上導(dǎo)致死亡的主要惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康，近年來，隨著工業(yè)的發(fā)展和大氣環(huán)境的污染導(dǎo)致肺癌的發(fā)病率和死亡率有所上升。由于早期肺癌癥狀的不典型性和隱蔽性，往往導(dǎo)致患者在發(fā)現(xiàn)肺癌時錯過了最佳治療時機。而在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期，一些腫瘤相關(guān)分子已經(jīng)發(fā)生變化，因此能否發(fā)現(xiàn)肺癌的特異性分子及其相關(guān)的作用機制對于肺癌的早期診斷以及爭奪治療時機和治療方面都有著重要的意義。TNFAIP8作為一個致癌基因首先發(fā)現(xiàn)在人頭頸部鱗狀細(xì)胞

2、癌的細(xì)胞系中，其含有一個死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)，與FHP蛋白相似，能夠競爭性抑制caspase8與誘導(dǎo)死亡信號復(fù)合物(DISC)結(jié)合從而抑制細(xì)胞的凋亡，參與腫瘤的形成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TNFAIP8在前列腺癌，食道癌，卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌，結(jié)直腸癌等許多人類腫瘤中發(fā)揮作用，我們也曾報道過，TNFAIP8在肺癌中過表達(dá)并且具有促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用，然而TNFAIP8的作用機制尚不十分清楚。Hippo通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條影響組織生長與發(fā)育

3、的通路，后來發(fā)現(xiàn)該通路在許多實體腫瘤中存在著失調(diào)，已有報道Hippo通路的異常與肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。盡管近年來研究者們對于Hippo通路的作用機制進(jìn)行了深入的研究，然而有關(guān)調(diào)控該通路的相關(guān)分子和作用機制還遠(yuǎn)沒有被揭示。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)改變TNFAIP8的表達(dá)可以影響Hippo通路的靶基因CTGF的表達(dá)水平，這提示了TNFAIP8的作用發(fā)揮可能與Hippo通路有關(guān)。因此，本研究的目的就是探索TNFAIP8促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖與侵襲的相關(guān)

4、機制，同時揭示TNFAIP8調(diào)節(jié)Hippo通路的潛在分子機制。
　　研究方法:采用蛋白免疫印跡(Western Blot)的方法對TNFAIP8蛋白以及Hippo通路的關(guān)鍵分子YAP及其靶基因CTGF和上游核心激酶成分LATS1，MST1/2和MOB1以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白E-CA，N-CA，Vimentin，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD、CDK4、CDK6、P27，侵襲相關(guān)蛋白MMP7等進(jìn)行相關(guān)蛋白定量的測定;采

5、用轉(zhuǎn)染和干擾技術(shù)以改變細(xì)胞系中TNFAIP8、YAP和LATS1的蛋白表達(dá)，并采用Westem Blot方法進(jìn)行效率的驗證;采用qRT-PCR的方法檢測CTGF的mRNA水平;核漿分離實驗和免疫熒光實驗檢測TNFAIP8蛋白對YAP蛋白核定位的變化以及TNFAIP8蛋白與LATS1蛋白的共定位情況;免疫共沉淀實驗檢測了TNFAIP8蛋白與LATS1蛋白之間的相互作用;采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測TNFAIP8對Hippo通路活性影

6、響的變化;集落形成實驗和基質(zhì)膠侵襲實驗分別檢測細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的變化;采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.TNFAIP8抑制Hippo通路的活性。我們首先檢測了TNFAIP8蛋白在正常支氣管上皮細(xì)胞(HBE)及4種肺癌細(xì)胞系(H1299 H446，A549，H460)中的基礎(chǔ)表達(dá)，并選取了相對低表達(dá)TNFAIP8的H460細(xì)胞系轉(zhuǎn)染了TNFAIP8表達(dá)質(zhì)粒

7、，而在高表達(dá)TNFAIP8的H1299細(xì)胞中采用SiRNA干擾其內(nèi)源性TNFAIP8的表達(dá)。熒光素酶報告基因顯示在H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TNFAIP8的表達(dá)質(zhì)粒能夠顯著增加TEAD的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)Hippo通路中關(guān)鍵分子YAP的負(fù)向靶基因CTGF的蛋白水平和mRNA水平（Hippo通路活性被抑制），而在H1299細(xì)胞中干擾TNFAIP8的表達(dá)后，Hippo通路活性呈現(xiàn)相反的改變（增加），CTGF的蛋白和mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，提示TNFAI

8、P8參與著Hippo通路活性的調(diào)節(jié)。2.TNFAIP8抑制Hippo通路的活性依賴于YAP及其入核。為了探索TNFAIP8影響Hippo通路活性的可能機制，我們在H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TNFAIP8質(zhì)粒后，發(fā)現(xiàn)YAP的蛋白總量增加而磷酸化水平下降，核漿分離實驗和免疫熒光實驗均顯示YAP在細(xì)胞核中的分布增加，而在H1299細(xì)胞中干擾TNFAIP8蛋白表達(dá)后，上述結(jié)果卻相反。此外，在干擾掉內(nèi)源性YAP的表達(dá)后，TNFAIP8對cyclinD1，

9、CDK6，P27，MMP7及CTGF的影響均消失，對Hippo通路活性的影響也消失，上述結(jié)果表明TNFAIP8發(fā)揮抑制Hippo通路活性的作用依賴于YAP的存在和入核。3.LATS1是TNFAIP8抑制Hippo通路活性的靶分子。為了進(jìn)一步探究TNFAIP8調(diào)節(jié)YAP的分子機制，我們檢測了Hippo通路中上游核心激酶LATS1，MST1/2和MOB1蛋白磷酸化水平的變化，Western Blot結(jié)果顯示在H460細(xì)胞中過表達(dá)TNFAIP

10、8后，能夠下調(diào)LATS1的磷酸化水平，然而在H1299細(xì)胞中干擾TNFAIP8后，LATS1的磷酸化水平增加，而LATS1的蛋白總量及MST1/2、MOB1的磷酸化水平均沒有發(fā)生明顯的變化。此外，在干擾LATS1的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染或干擾TNFAIP8，其對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、MMP7及YAP和CTGF的影響均被減弱。免疫熒光實驗顯示TNFAIP8與LATS1存在著共定位，免疫共沉淀技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn):TNFAIP8與LATS1能夠相互作用。上述結(jié)果

11、表明，TNFAIP8是通過與LATS1相互作用，下調(diào)LATS1的磷酸化水平，進(jìn)而對YAP的磷酸化水平、蛋白水平及其入核進(jìn)行調(diào)節(jié)，提示LATS1是TNFAIP8參與調(diào)節(jié)Hippo通路活性的作用靶點。4.中斷Hippo通路能夠解除TNFAIP8促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲。為了證實TNFAIP8促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲是通過Hippo通路來實現(xiàn)的，我們在H460細(xì)胞中分別干擾Hippo通路的核心激酶LATS1和關(guān)鍵分子YAP的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TN