五重熒光定量RT-PCR檢測甲型流感病毒方法的建立和應用及2010～2013年杭州地區(qū)人H3N2病毒流行病學分析.pdf

1、目的:
　　建立一種快速、敏感、特異的五重熒光定量RT-PCR方法檢測甲型流感的不同亞型，并對2010～2013年杭州地區(qū)甲型流感H3N2進行分子流行病學調(diào)查，通過選擇壓力分析為疫苗研制提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.設計甲型禽流感病毒基質(zhì)蛋白(M)區(qū)、H3、H5、H7及內(nèi)參基因(RNaseP，RP)的引物及Taqman探針，并對RT-PCR反應體系中，五套引物及探針的濃度進行優(yōu)化。
　　2.合成各基因標準品片段

2、，將其連接到質(zhì)粒載體PmdTM19-T Simple Vector上進行轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)。經(jīng)鑒定后提取質(zhì)粒DNA，利用NanoDrop ND-2000核酸檢測儀測量質(zhì)粒DNA的濃度，確定DNA的拷貝數(shù)作為敏感度的標準品定量母液。根據(jù)實驗需要，將標準品定量母液稀釋至所需最高濃度(107copies/mL)，并連續(xù)10倍稀釋至最低濃度(102copies/mL)，然后用本方法和WHO推薦的方法進行靈敏度比較。
　　3.在本方法的反應體系中加

3、入其它18種呼吸道病原微生物[乙型流感病毒，禽流感H5N3、H5N1、H9N2病毒，人副流感病毒Ⅰ～Ⅲ型，呼吸道合胞病毒A和B型，肺炎支原體，銅綠假單胞菌，肺炎克雷伯菌，鮑曼不動桿菌，金黃色葡萄球菌，白念珠菌]提取的模板，檢測反應體系的特異性。
　　4.將確定好的各質(zhì)粒DNA濃度，根據(jù)實驗需要，稀釋至所需要的濃度(106copies/mL)，連續(xù)三次10倍稀釋至(104copies/mL)，用本方法分別檢測三次，檢測反應體系的（批

4、內(nèi)）重復性，并與WHO推薦方法的結(jié)果進行比較。
　　5.用本方法對262例疑似患者與正常人的痰液標本進行檢測，并與上海之江生物有限公司生產(chǎn)的市售試劑盒的方法結(jié)果比較。
　　6.2010年1月至2013年12月浙江大學附屬第一醫(yī)院流感監(jiān)測網(wǎng)絡相關數(shù)據(jù)，分別采用研究試劑所有病例的咽拭子均進行H3N2流感病毒檢測，并經(jīng)過血凝抑制實驗和流感病毒核酸監(jiān)測證實。
　　7.病原學檢測:樣本先進行流感病毒核酸檢測，采用五重RT-PCR

5、檢測試劑盒。
　　8.序列收集:所有H3N2的HA(hemagglutinin)與NA(neuraminidase)基因完整序列均在NCBI上搜索查找獲取，搜索關鍵詞分別為:“China”，“Hangzhou”，“Hong Kong”加“H3N2 HA gene complete cds”,“H3N2 NA gene complete cds”，香港地區(qū)H3N2基因序列并入中國整個國家序列中。
　　9.HA與NA基因序列篩選

6、與比對:依據(jù)病毒的分離地、時間、宿主為前提條件進行整合，條件相同序列只取一條。H3N2基因序列按照地區(qū)分為中國HA(133)、杭州HA(69)和杭州NA(69)三組。
　　10.分子鐘與人口感染動力學分析:利用jModeltest軟件找出序列最適堿基替換模型，按照手冊中要求參數(shù)設置(http://code.google.com/p/jmodeltest2)。再使用Beast軟件中貝葉斯MCMC(Bayesian Markov ch

7、ain Monte Carlo)法對數(shù)據(jù)集進行堿基替換速率、最近共同祖先(Time of most recent common ancestor, TMRCA)和Skyline plot分析，依據(jù)操作手冊中要求的參數(shù)(http://beast.bio.ed.ac.uk/Tutorials/)進行設置，我們建立一個嚴格分子鐘的指數(shù)生長模型，通過Tracer軟件對所得結(jié)果進行分析，并規(guī)定有效樣本大?。‥SS）＞200，最終計算分子鐘（堿基替

8、換速率）與時間人口感染動力學關系圖，用Beast軟件包中TreeAnnotator程序，計算獲最大可信樹（MCCT,），用FigTree對所得到的樹進行編輯，獲得H3N2病毒的HA基因在時間標尺與地理位置上的進化圖。
　　11.甲型流感病毒H3N2選擇壓力分析:選擇壓力(dN-dS)可以反映病毒在收到外界環(huán)境進行選擇時的進化情況，其中，dN（non-synonymous substitutions）代表非同義突變率，dS(syno

9、nymous substitutions)表示同義突變率。選擇壓力計算時以密碼子發(fā)生非同義突變率dN與同義突變率dS的差值來確定選擇的方向性，中性選擇(dN=dS，dN-dS=0)，正向選擇(dN-dS＞0)，凈化選擇（負向選擇，dN-dS＜0）。
　　12.與選擇壓力（正向選擇）相關的蛋白質(zhì)表達:在PDB數(shù)據(jù)庫中找出與H3N2基因密碼子相似程度較高(＞30％)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行同源建模，比較各選擇壓力位點下的蛋白質(zhì)

10、結(jié)構(gòu)的變化。分別在蛋白質(zhì)空間三維結(jié)構(gòu)圖中進行標記。
　　結(jié)果:
　　1.引物與探針的設計與濃度優(yōu)化:引物與探針濃度采用矩陣法進行，以獲得的Ct值較小而熒光強度最大的濃度為反應體系最合適濃度。
　　2.五重熒光定量RT-PCR反應體系的靈敏度:五重熒光定量RT-PCR反應在檢測甲型禽流感病毒基質(zhì)蛋白(M)區(qū)、H3、H5、H7及RNase P的合成片段時，各自靈敏度與WHO推薦的方法一致，均達到了在102copies/mL

11、時能擴增出條帶。
　　3.五重熒光定量RT-PCR反應體系的特異性:將上述18種呼吸道病原菌的核酸提取物作為模板分別加入多重熒光定量RT-PCR進行測定，除流感病毒出現(xiàn)很好的陽性結(jié)果外，其它所有病毒的檢測結(jié)果均呈陰性。特異性達到了100％。
　　4.五重熒光定量RT-PCR反應體系的重復性（批內(nèi)）:不同濃度核酸各自的檢測Ct值標準差在0.193～0.451之間，變異系數(shù)(CV)最高達1.999％，本方法具有較好的批內(nèi)重復性。

12、
　　5.五重熒光定量RT-PCR反應體系的檢測符合率:使用本方法與已有試劑對臨床262例疑似患者和正常人的痰液標本應用多重熒光定量RT-PCR方法進行檢測。
　　6.2010～2013年杭州地區(qū)H3N2感染率分析，不同年度間H3N2感染率差異具有統(tǒng)計學意義(x2=14.004，P＜0.05)，不同性別和年齡組間差異無統(tǒng)計學意義(x2=3.552，x2=2.691，P＞0.05)。
　　7.我國流行甲型流感病毒H3N2

13、的HA基因堿基替換速率為1.6584×10-3(95％可信區(qū)間:1.5325×10-3～1.7988×10-3），TMRCA:1945年（95％可信區(qū)間:1940～1952年），人口感染規(guī)模評價出現(xiàn)了兩次高峰且感染率總趨勢呈現(xiàn)上升狀態(tài)。
　　8.通過SLA法計算可得到陽性選擇位點4個，14，153，209，278。陰性位點有238個。
　　結(jié)論:
　　1.多重熒光定量RT-PCR技術是利用TaqMan技術在普通PCR原

14、有的一對特異性引物基礎上增加了一條特異性的熒光雙標記探針。利用該探針能與病原核酸特異性結(jié)合，而且結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域，探針的5'端和3'端分別標記不同的熒光素，在PCR擴增過程中，利用檢測系統(tǒng)中熒光量的變化，通過檢測儀檢測并記錄熒光信號的變化判定檢測結(jié)果，我們利用此原理建立了多重熒光RT-PCR法檢測不同的流感亞型。
　　2.檢測方法的評價:通過標準毒株與臨床樣本的檢測比較，發(fā)現(xiàn)我們建立的多重熒光RT-PCR特異性和靈敏度均達

15、到了WHO推薦方法的特異性和靈敏度水平，而且我們的方法更快速，簡便，并只需一次反應可同時檢測甲型禽流感病毒和H3、H5、H7不同甲型禽流感不同亞型。
　　3.臨床標本驗證:通過分別使用我們試劑與之江在售試劑，同時檢測臨床病人與正常人標本后，我們得出兩者符合率達到了100％。
　　4.通過對該方法的多角度評價，可知該方法具有快速、穩(wěn)定、靈敏度和特異性高、重復性好的特點，對于臨床上檢測流感病毒及其不同亞型具有一定的意義。

16、　　5.我們推測2012年后的H3N2病毒株可能是其他省份病毒遷徒所致;2013年病毒株HA與NA基因序列，均處于2012年病毒株樹分支的下級，我們推斷2013年的病毒株為2012年病毒株復蘇后感染再傳播，2012年H3N2病毒株感染后，使部分感染人群產(chǎn)生獲得免疫，對于此病毒株再次感染具有一定的保護作用，致使2013年杭州地區(qū)H3N2病毒流感樣人群中感染率下降。
　　6.H3N2基因堿基置換速率為1.6525×10-3(95％可信

17、區(qū)間:1.4796×10-3～1.8287×10-3)，要明顯低于H1N1（7.06×10-3，95％可信區(qū)間:5.4×10-3～8.8×10-3）、H5N1（8.87×10-3，95％可信區(qū)間:7.0×10-3～10.72×10-3）等高致病性禽流感的堿基置換速率，這也是H3N2在我國流行的感染病毒株，多以低變異株為主的主要原因。由堿基置換速率我們推測H3N2病毒H3基因的產(chǎn)生時間:1945年（95％可信區(qū)間:1940～1952年），

18、由于H3N2病毒存在一組未在人類感染的病毒進化分支，因此剔除未感染人病毒組，計算人感染H3N2的H3基因產(chǎn)生時間為:1960年(95％可信區(qū)間:1957～1962年)與實際H3N2流行發(fā)生時間相符。同時H3N2病毒在我國感染的規(guī)模與時間的分布出現(xiàn)了兩次高峰且感染率總趨勢呈現(xiàn)上升狀態(tài)。
　　7.可將HA1基因的153(137)位于A抗原區(qū)，209(193)位于B抗原區(qū)，278(262)位于E抗原區(qū)，作為研制H3N2流感疫苗的依據(jù)，在