狼腸道菌群生態(tài)及犬科線粒體基因組比較和系統(tǒng)發(fā)育.pdf

1、作為現(xiàn)存食肉目動物中分布最為廣泛的類群,犬科動物與人類生活有著千絲萬縷的聯(lián)系。在對犬科動物的研究過程中,消化生理學(xué)領(lǐng)域的研究具有舉足輕重的地位,其中有關(guān)消化道菌群生態(tài)的研究近年成為學(xué)術(shù)界的熱點話題。盡管目前對家犬腸道菌群的研究已經(jīng)比較深入,但是狼的消化道菌群目前仍是個未知數(shù)。為了解狼的腸道菌群組成和多樣性特征,本文第一部分通過構(gòu)建菌群16S rRNA基因文庫和進行系統(tǒng)發(fā)育分析,對采集自中國內(nèi)蒙古自治區(qū)達賚湖自然保護區(qū)附近的3只健康成年狼

2、的糞便菌群結(jié)構(gòu)進行了分析。我們將3只狼的糞便樣品分別構(gòu)建16S rRNA基因文庫,從中隨機挑取550個克隆進行檢測,共得到307個不同的非嵌合體的細(xì)菌16S rRNA基因序列。根據(jù)97％的序列相似性,這些序列可劃分為65個臨時分類單元(OUT),其中有17個OUT(代表著98個克隆的16S rRNA基因序列,占克隆總數(shù)的31.9％)與GenBank和RDPⅡ數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有序列的相似度小于98％,為未分類、未鑒定的細(xì)菌。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,狼

3、糞便菌群共有5個細(xì)菌門組成,按照多樣性高低依次是:Firmicutes(60％ of totalOTUs),Bacteroidetes(16.9％),Proteobacteria(9.2％),Fusobacteria(9.2％)和Actinobacteria(4.6％)。Clostridiales是狼糞便菌群中最大的細(xì)菌目,占據(jù)了OUT總數(shù)的53.8％。這一細(xì)菌目共由5個科組成,其中Lachnospiraceae是豐富度最高的一個科,其

4、余四個科依次是:Ruminococcaceae,Clostridiaceae,Peptococcaceae和Peptostreptococcaceae。通過將本文研究結(jié)果與人類和家犬等其它哺乳動物腸道菌群結(jié)構(gòu)進行比較發(fā)現(xiàn),狼糞便菌群結(jié)構(gòu)與其它哺乳動物基本相同,狼和家犬在Actinobacteria門和Fusobacteriales門的細(xì)菌組成和數(shù)量上存在較大差別。
　　 線粒體基因組是比較基因組學(xué)研究的理想工具。家犬(Canis

5、 lupus familiaris)的線粒體全基因組測序于1997年完成,至今已測序的犬科動物有四種:家犬、狼(Canislupus)、郊狼(Canis latrans)和赤狐(Vulpes Vulpes)。本課題組于2008年對分布于青海省的西藏狼(Canis lupus laniger)的線粒體基因組進行了測序。然而,中國分布的其他種群的狼和其他犬科動物的線粒體基因組數(shù)據(jù)未見報道。因此,本文第二部分內(nèi)容是應(yīng)用Long-PCR和引物步

6、移法,結(jié)合克隆測序法,對中國分布的豺、貉和內(nèi)蒙古地區(qū)分布的狼的線粒體基因組進行測序,同時通過與已報道的犬科動物線粒體基因組進行比對分析,探討犬科動物線粒體基因組組成和結(jié)構(gòu)的異同,從而總結(jié)出犬科動物線粒體基因組的結(jié)構(gòu)特點。經(jīng)測序,蒙古狼、豺和貉線粒體基因組全長分別是16709 bp、16672 bp和16713 bp,三種犬科動物線粒體基因組均包含13個蛋白質(zhì)編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因和1個非編碼區(qū)。序列堿基的組成存在

7、明顯的A-T偏好性。tRNA基因中除tRNA-Ser(AGY)缺少雙氫尿嘧啶(DHU)臂以外,其余均能折疊成典型的三葉草二級結(jié)構(gòu)。在編碼蛋白質(zhì)基因的所有密碼子中,以編碼亮氨酸(Leu)的其中一個密碼子(CTA)和編碼異亮氨酸(Ile)的三個密碼子(ATT,ATC,ATA)使用頻率最高。大多數(shù)密碼子的使用犬科各種動物高度一致,蒙古狼和西藏狼的某些起始和終止密碼子與其他犬科動物存在差別。通過對4個屬8個種(其中包括狼的三個亞種)犬科動物的線

8、粒體基因組的堿基組成和基因結(jié)構(gòu)進行比較發(fā)現(xiàn),犬科動物線粒體基因組序列大部分區(qū)域高度一致,序列差異主要存在于非編碼區(qū)的兩翼區(qū)域(ETAS區(qū)和CSB區(qū))。序列長度的差異主要由非編碼區(qū)重復(fù)序列(RS-3)重復(fù)次數(shù)的差異所致。通過對犬科動物之間堿基替代情況進行分析發(fā)現(xiàn),不同種犬科動物的同一功能部位堿基替代速率較為一致,同種犬科動物的不同功能基因的堿基替代率差異較大。13種蛋白質(zhì)編碼基因的堿基替代率也有明顯不同,其中以L鏈編碼的ND6基因的堿基替

9、代率與其他蛋白質(zhì)編碼基因的差異最為顯著。犬科動物線粒體基因組各功能部位中以tRNA基因的堿基替代率最低,說明tRNA基因在進化過程中高度保守。
　　 犬科動物系統(tǒng)發(fā)育地位的探討在食肉目進化生物學(xué)研究中占有重要的地位。已有學(xué)者基于形態(tài)學(xué)和某些分子生物學(xué)數(shù)據(jù)進行過相關(guān)的分析,但由于測序方法的限制和數(shù)據(jù)庫中基因序列的缺乏,未見基于線粒體基因組全序列的犬科動物分子進化的研究。作為本文研究的第三部分內(nèi)容,我們在對蒙古狼、豺、貉線粒體基因組

10、測序以后,應(yīng)用所測得的蒙古狼和早期測得的西藏狼的線粒體基因組序列結(jié)合數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有狼的亞種的數(shù)據(jù),對這兩個地區(qū)狼的系統(tǒng)發(fā)育地位進行定位。同時利用測得數(shù)據(jù)結(jié)合GenBnak中已有線粒體基因組全序列的數(shù)據(jù),進行了犬科和犬型亞目的系統(tǒng)發(fā)育重建?；?2SrRNA+16S rRNA+H鏈上的12個蛋白質(zhì)編碼基因的聯(lián)合數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,在已報道的狼亞種數(shù)據(jù)中,西藏狼的分化時間最早,其次為阿拉伯狼(Canis lupusarabs),蒙古狼與歐

11、亞狼(Canis lupus lupus)的系統(tǒng)發(fā)育地位最為接近。對犬型亞目系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),犬型亞目可明顯劃為Cynoidea和Arctoidea兩大類群。犬科的4個屬(犬屬、豺?qū)?、狐屬、貉?可分為3個進化地位平等的分支,進化時間估算貉屬最先從犬科中分化出來。最大簡約法、最大似然法和貝葉斯法的推斷結(jié)果均驗證了除郊狼以外的其他犬屬動物的單源性。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)所顯示的狼和家犬的分化地位暗示著應(yīng)將家犬作為狼的亞種進行劃分。通過堿基替代率估算的家