海洋曲霉屬真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的基因組挖掘與遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建.pdf

1、海洋微生物來(lái)源的天然產(chǎn)物因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性而備受關(guān)注，特別是有研究證實(shí)海洋動(dòng)植物體內(nèi)的微生物是其活性化合物的真正生產(chǎn)者。海蟑螂(Ligia oceanic)是中國(guó)南方沿海漁民治療跌打損傷常用的藥用動(dòng)物，但目前對(duì)海蟑螂及其微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物（Secondary Metabolites，SMs）的研究較少，難以確認(rèn)其藥用活性成分。
　　本研究以海蟑螂腸道內(nèi)海洋真菌Z5為研究對(duì)象，經(jīng)rDNA序列鑒定為曲霉屬菌株(Aspergi

2、llus sp.)。應(yīng)用二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)該菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析及antiSMASH基因簇分析，結(jié)果顯示Z5菌株基因組大小為33.8Mbp，系統(tǒng)進(jìn)化處于A.versicolor分支，共含有89個(gè)SMs生合成基因簇，結(jié)合One-Strain-Many-Compounds(OSMAC)結(jié)果說(shuō)明:該菌具有合成多種SMs的潛能;全基因組挖掘的SMs基因簇?cái)?shù)量遠(yuǎn)超OSMAC分析的化合物數(shù)量，多數(shù)基因簇在現(xiàn)有培養(yǎng)條件下為沉默狀態(tài)，如激活這些沉

3、默基因簇的表達(dá)，極可能獲得新型活性化合物。為開(kāi)展該菌株的生物合成研究而獲得新型化合物，本研究構(gòu)建了Z5的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，探索優(yōu)化原生質(zhì)體制備純化方法，確定可通過(guò)β-巰基乙醇預(yù)處理及蔗糖分層純化法獲得再生率為94％的高質(zhì)量原生質(zhì)體，并應(yīng)用Double-Joint PCR替代傳統(tǒng)酶切連接法構(gòu)建基因盒，最終通過(guò)PEG/CaCl2轉(zhuǎn)化，獲得Z5的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。
　　本研究為海洋真菌新型天然產(chǎn)物的獲得提供重要來(lái)源，為開(kāi)發(fā)應(yīng)用該類(lèi)真菌天然產(chǎn)物