活血化瘀中藥有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠胃平滑肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及JNK信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：
　　糖尿病胃輕癱（DGP）是以胃排空延遲為主要特點(diǎn)的癥候群。主要以上腹燒灼感、腹痛、惡心、嘔吐、餐后飽脹及早飽感為表現(xiàn)。糖尿病胃輕癱這一名詞在1958年首次被Ksaaander提出。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的變化，這種并發(fā)癥在全球范圍內(nèi)逐年遞增，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者中超過(guò)50％為DGP[1-2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及預(yù)后。
　　目前國(guó)內(nèi)外研究表明DGP的發(fā)病機(jī)制主要為高血糖、自主神經(jīng)

2、功能障礙、胃腸激素分泌異常、平滑肌損害、微血管病變、Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）缺失以及代謝紊亂等。胃平滑肌細(xì)胞是胃腸運(yùn)動(dòng)最終的執(zhí)行者，DGP的發(fā)病機(jī)制中胃平滑肌損傷是胃動(dòng)力異常的最終環(huán)節(jié)。在一些超微結(jié)構(gòu)研究中可見(jiàn)DGP大鼠胃竇平滑肌細(xì)胞排列紊亂，且平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)大量溶解，在胃電活動(dòng)的研究中可見(jiàn)DGP大鼠胃平滑肌的收縮頻率及振幅下降，由于胃的舒縮功能與胃的機(jī)械運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切，這就導(dǎo)致了胃松弛性增加[3]。目前自噬在糖尿病并發(fā)癥中的研究較多

3、，自噬即自我吞噬，它是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種細(xì)胞內(nèi)代謝降解的生命現(xiàn)象。自噬溶酶體是自噬的后期階段，它標(biāo)志著自噬的存在。自噬是一把雙刃劍，在生理狀態(tài)下，自噬可以清除胞內(nèi)功能損傷及衰老的細(xì)胞器，維持主要的合成代謝。但是，如果過(guò)度激活自噬則可以引起細(xì)胞內(nèi)大量必要分子和細(xì)胞器被分解，從而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)Ⅱ型程序性死亡。Beclin1及LC3是參與自噬的重要蛋白， Beclin1構(gòu)成了自噬的啟動(dòng)蛋白，LC3是自噬溶酶體膜的延伸的標(biāo)志性蛋白質(zhì)。JN

4、K信號(hào)通路是介導(dǎo)自噬的一條重要通路，JNK信號(hào)通路主要是通過(guò)使Bcl-a家族蛋白磷酸化進(jìn)而上調(diào)自噬基因Beclin-1來(lái)促進(jìn)自噬發(fā)生。在糖尿病胰島素抵抗的研究中發(fā)現(xiàn)抑制JNK通路可下調(diào)自噬，進(jìn)而改善糖尿病胰島素抵抗[4-5]。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胃組織中可檢測(cè)到高表達(dá)的自噬蛋白，因此自噬的功能異常在DGP的發(fā)生、發(fā)展上起著重要的作用。但在高糖誘導(dǎo)的離體胃平滑肌細(xì)胞（GSMC）中是否存在過(guò)度自噬，是否與JNK信號(hào)通路有關(guān)，尚未知。

5、r>　　在臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中由丹參、川芎、水蛭組成的活血化瘀中藥復(fù)方治療DGP上取得了良好的療效，之前的研究顯示活血化瘀通絡(luò)中藥可以通過(guò)促進(jìn)ICC活動(dòng)、調(diào)節(jié)胃腸激素分泌及修復(fù)胃血管內(nèi)皮等作用改善DGP胃排空障礙。但活血化瘀通絡(luò)中藥的治療機(jī)制沒(méi)有完全明確，本實(shí)驗(yàn)采用活血化瘀組方的有效成分，即丹參酮Ⅱ-A（TSN），川芎嗪（TMP）、水蛭素（Hirudin）共同干預(yù)由高糖誘導(dǎo)的大鼠胃平滑肌細(xì)胞，觀察其對(duì)GSMC自噬蛋白及其JNK通路表達(dá)的影響

6、，研究活血化瘀中藥有效成分對(duì)平滑肌細(xì)胞收縮力的影響，以探討活血化瘀通絡(luò)中藥組方有效成分對(duì)DGP可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1將大鼠胃平滑肌細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、高糖組、川芎嗪濃度梯度組、丹參酮Ⅱ-A濃度梯度組、水蛭素濃度梯度組，用MTT法檢測(cè)丹參酮Ⅱ-A,川芎嗪、水蛭素的最適藥物濃度。
　　2實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（25mmol/l葡萄糖）、高糖組（40mmol/l葡萄糖）、中藥組（40mmol/l葡萄糖加中藥有效

7、成分共孵育）、JNK抑制劑組（40mmol/l葡萄糖加20μmol/L SP600125共孵育），各個(gè)組分別給予藥物處理24小時(shí)。
　　3各組應(yīng)用丫啶橙染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體。
　　4各組細(xì)胞戊二醛固定后應(yīng)在倒置顯微鏡下用顯微尺測(cè)量細(xì)胞長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，進(jìn)而測(cè)定細(xì)胞收縮力。
　　5采用Western blot方法檢測(cè)LC3-Ⅱ、Beclin-1、JNK、P-JNK蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1活血

8、化瘀中藥組方有效成分對(duì)細(xì)胞收縮力的影響：測(cè)量各組大鼠平均細(xì)胞長(zhǎng)度，與正常對(duì)照（47.13±8.98μm）組比較，高糖組（62.63±4.44μm）大鼠GSMC明顯舒張，GSMC的平均長(zhǎng)度顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中藥組（51.21±6.99μm）及JNK抑制劑（49.79±6.18μm）組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與高糖組比較，中藥組大鼠GSMC有較明顯的收縮，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），JNK抑制劑組（49.7

9、9±6.18μm）大鼠GSMC明顯的收縮，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與JNK抑制劑組比較，中藥組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。提示活血化瘀中藥組方有效成分可以促進(jìn)胃平滑肌細(xì)胞收縮，可能通過(guò)抑制JNK通路發(fā)揮作用。
　　2活血化瘀中藥組方有效成分對(duì)GSMC自噬溶酶體的影響：倒置顯微鏡下可見(jiàn)正常組細(xì)胞呈綠色熒光，與正常對(duì)照組相比，高糖組GSMC胞質(zhì)中亮桔紅色點(diǎn)狀熒光明顯增加。與高糖組相比，中藥組亮桔紅色點(diǎn)狀熒光減少，JNK抑制劑組

10、，紅色熒光也明顯減少。提示高糖可以誘導(dǎo)GSMC過(guò)度自噬，而活血化瘀中藥組方有效成分可以抑制自噬溶酶體的生成，下調(diào)高糖造成的細(xì)胞過(guò)度自噬從而減少細(xì)胞損傷，保證細(xì)胞正常的舒縮功能。這可能為其治療DGP胃動(dòng)力障礙的機(jī)制之一。
　　3活血化瘀中藥組方有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)的GSMC細(xì)胞Beclin1和LC3蛋白及JNK磷酸化的影響：結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，經(jīng)高糖處理后LC3-Ⅱ、Beclin-1、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0

11、.05），與高糖組比較，中藥組及JNK抑制劑組LC3-Ⅱ、Beclin-1、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)顯著減輕（P＜0.05），而正常對(duì)照組、中藥組及JNK抑制劑組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。提示高糖上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1及JNK相關(guān)蛋白JNK、p-JNK，誘導(dǎo)自噬過(guò)度增加，可能是通過(guò)激活JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)GSMC的自噬。而活血化瘀中藥組方有效成分抑制JNK通路下調(diào)細(xì)胞過(guò)度自噬從而減少細(xì)胞損傷，這可能為其治療DG