TNF-α、GSK-3β和RANKL在糖尿病性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展中的作用研究.pdf

1、【目的】探討TNF-α、GSK-3β及 RANKL在糖尿病性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展中的作用?！痉椒ā?br>　　（1）建立糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型：選用雌性 SD大鼠，隨機分為對照組及實驗組，實驗組：選取成年雌性大鼠，用高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，禁食12小時腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）50mg/kg，一周后重復(fù)檢查血糖濃度>7.8mmol/L表示糖尿病大鼠造模成功。1周后用10％水合氯醛3．5ml／kg腹腔注射麻醉后，摘除雙側(cè)卵巢。繼續(xù)喂養(yǎng)至1

2、2周。同時納入病程相近的假手術(shù)組大鼠作為陽性對照，所有大鼠測每周體重變化,麻醉狀態(tài)下取血清應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠骨鈣素（OC）,核因子kb受體活化因子配基（RANKL）,糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），P38絲裂原活化蛋白酶（P38-MAPK）,腫瘤壞死因子（TNF-α）等細(xì)胞因子，留取兩組大鼠L6椎體和左股骨等骨標(biāo)本,進行骨密度分析，HE染色形態(tài)學(xué)分析，應(yīng)用多媒體病理圖像分析軟件進行骨組織形態(tài)計量學(xué)分析。
　　(2)將

3、實驗組及對照組體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞，用噻唑藍(lán)比色法（MTT）以及流式細(xì)胞儀進行成骨及破骨細(xì)胞活性、細(xì)胞周期以及凋亡的檢測；用酶標(biāo)儀檢測堿性磷酸酶(ALP)活性或免疫組化檢測I型膠原表達(dá)來測定成骨細(xì)胞的分化情況，通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺藍(lán)(TB)染色、檢測破骨細(xì)胞的分化情況。細(xì)胞培養(yǎng)基分別以陰性干預(yù)劑、GSK-3β抑制劑，TNF-α拮抗劑和RANKL拮抗劑進行處理，檢測骨細(xì)胞的增殖、凋亡的變化，用RT-PCR檢

4、測GSK-3β、TNF-α、RANKL基因水平在各分組的表達(dá)變化。
　　【結(jié)果】
　　(1)成功建立糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松模型，8和12周實驗組大鼠骨密度明顯低于對照組。成功分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。酶聯(lián)免疫吸附實驗表明，糖尿病模型組中RANKL水平，GSK-3β，p38MAPK和TNF-α明顯升高，而骨鈣素（OC）水平和胰島素（INS）均顯著降低。
　　(2)MTT結(jié)果顯示成骨細(xì)胞的增殖在GSK-3β抑制劑均低于對照組

5、，成骨細(xì)胞的增殖在TNF-α拮抗劑組和RANKL拮抗劑組明顯高于對照組。破骨細(xì)胞的增殖在GSK-3β抑制劑增殖均低于對照組，破骨細(xì)胞增殖在TNF-α拮抗劑組和RANKL拮抗劑組非常接近對照組。在所有的相應(yīng)的組中，實驗組骨細(xì)胞增殖明顯強于對照組。流式細(xì)胞儀顯示在GSK-3β抑制劑組中，實驗組破骨細(xì)胞的凋亡率顯著低于對照組，在TNF-α拮抗劑組，RANKL拮抗劑組中，實驗組破骨細(xì)胞的凋亡率顯著高于對照組，在GSK-3β抑制劑組，TNF-α拮

6、抗劑組中，實驗組成骨細(xì)胞的凋亡率顯著低于對照組；在RANKL拮抗劑組，實驗組成骨細(xì)胞的凋亡率和對照組大鼠無顯著差異。RT-PCR顯示在GSK-3β抑制劑組中，TNF-α和 RANKL基因表達(dá)水平均升高，但TNF-α和RANKL基因表達(dá)水平在實驗組中均略低于對照組。GSK-3β基因表達(dá)水平在TNF-α拮抗劑和RANKL拮抗劑組降低；GSK-3β基因的表達(dá)水平在實驗組明顯低于對照組。
　　【結(jié)論】
　　1、實驗性糖尿病大鼠卵巢切

7、除成功建立糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型。糖尿病模型組中RANKL水平，GSK-3β，p38MAPK和TNF-α明顯升高，而骨鈣素（OC）水平和胰島素（INS）均顯著降低。
　　2、在糖尿病模型大鼠中，TNF-α，GSK-3β和RANKL水平較對照組升高；GSK-3β可以促進成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖，并抑制TNF-α和RANKL的表達(dá)；TNF-α和RANKL對破骨細(xì)胞的增殖影響不大，抑制成骨細(xì)胞的增殖；還能促進GSK-3β表達(dá)；三者之間的