代謝性內(nèi)毒素血癥在肝胰島素抵抗中對肝細(xì)胞線粒體功能的影響.pdf

1、目的：
　　1、通過建立大鼠代謝性內(nèi)毒素血癥及肝胰島素抵抗模型，探討代謝性內(nèi)毒素血癥對肝線粒體結(jié)構(gòu)與能量代謝的影響；
　　2、通過體外實驗，探討內(nèi)毒素（LPS）對大鼠正常肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及能量代謝的直接影響。
　　方法：
　　在體實驗：30只雄性SD大鼠隨機分三組（每組10只）：正常對照組（NC組）、高果糖組（HFD組，10％果糖水喂養(yǎng)）、LPS組（皮下注射LPS300μg.kg-1.d-1）。每周檢測并記錄大鼠

2、體重，8周末，禁食12 h以上，腹腔注射糖耐量實驗結(jié)束后，經(jīng)乙醚麻醉腹主動脈采血，4℃3500 r/min離心10 min，取血漿分裝后置于-40℃保存。分離肝臟組織，部分置于4%多聚甲醛溶液中固定12~24 h，沖洗修整，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋切片，行蘇木素伊紅染色（H&E染色）；剩余樣本置液氮速凍后轉(zhuǎn)-80℃保存。
　　1、腹腔注射糖耐量實驗（IPGTT）
　　每周檢測大鼠體重變化，8周末，空腹腹腔注射50%葡萄糖溶液（2 g/

3、kg）。尾靜脈采血，采用快速血糖儀（羅氏活力型）分別檢測注射前（0 min）與注射后（15 min、30 min、120 min）血糖水平。
　　2、血漿肝酶、LPS檢測及肝胰島素抵抗評估
　　采用酶法測定血糖、血漿 AST及 ALT；鱟試劑法檢測血漿 LPS水平；ELISA法檢測胰島素變化，計算胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR），

4、公式為：HOMA-IR=空腹血糖（FPG, mmol/L）×空腹胰島素（FINS, EU/ml）/22.5。
　　3、氧化損傷產(chǎn)物及能量代謝指標(biāo)檢測
　　采用酶法檢測并計算血漿中 GSH-PX的水平；ELISA法檢測血漿中氧化損傷產(chǎn)物（8-OhdG、MDA、4-HNE）及能量代謝指標(biāo)（ADP、ATP）的表達(dá)。
　　4、肝臟組織病理學(xué)檢測
　　于4%多聚甲醛固定液中取出肝臟組織，沖洗修整后，梯度酒精脫水，二甲苯透明

5、，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度5μm，行H&E染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。
　　5、Western blot分析
　　采用 Western blot檢測肝組織胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白（p-IRS1Tyr632、IRS1、p-PI3KTyr458、PI3K）及線粒體內(nèi)膜受體蛋白（UCP2）表達(dá)。
　　離體實驗：采用改良膠原酶二步灌流法，體外分離培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞并隨機分為四組：正常對照組（NC組，DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)）、高果糖組

6、（HFD組，培養(yǎng)液+4.5 g/L果糖水）、LPS組（培養(yǎng)液+10 mg/L LPS）、果糖并LPS干預(yù)組（H+L組，培養(yǎng)液+4.5 g/L果糖水+10 mg/L LPS）。20 h后，吸取并分裝細(xì)胞上清液，胰酶（含EDTA）消化，2000 r/min離心3 min后棄上清，收取肝細(xì)胞于-40℃冷凍保存。
　　1、氧化損傷產(chǎn)物及能量代謝指標(biāo)檢測
　　采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中氧化損傷產(chǎn)物（8-OhdG、MDA、4-HN

7、E）及能量代謝指標(biāo)（ADP、ATP）的表達(dá)。
　　2、Western blot分析
　　采用Western blot檢測肝細(xì)胞中胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白（p-IRS1Tyr632、IRS1、p-PI3KTyr458、PI3K）、線粒體內(nèi)膜受體蛋白（UCP2）表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　在體實驗：
　　1、體重變化及糖耐量結(jié)果
　　實驗期間，各組大鼠總體狀態(tài)良好。與NC組相比，HFD組與LPS組大鼠體重在2~

8、8周顯著增高（P＜0.01，P＜0.05）。HFD組與LPS組各時間點血糖均顯著高于NC組（P＜0.01，P＜0.05），表明HFD組與LPS組大鼠發(fā)生糖耐量異常。
　　2、血漿肝酶、LPS檢測及肝胰島素抵抗評估結(jié)果
　　HFD組與LPS組的肝酶、FINS、FPG、LPS水平及HOMA-IR顯著高于NC組（P＜0.01），HFD組與LPS組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3、氧化損傷產(chǎn)物及能量代謝指標(biāo)變化
　

9、　HFD組與LPS組8-OhdG、MDA、4-HNE及GSH-PX顯著高于NC組（P＜0.01）， HFD組與LPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。能量代謝指標(biāo)，HFD組與 LPS組ADP、ATP與NC組相比顯著降低（P＜0.01），HFD組與LPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4、肝組織病理學(xué)變化
　　NC組肝臟呈暗紅色，無油膩感，H&E染色后光鏡下可見肝索呈放射狀排列。HFD組與LPS組肝臟有明顯油膩感；鏡下可見肝細(xì)胞包

10、漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴空泡并伴有氣球樣變。
　　5、Western blot結(jié)果
　　與NC組相比，HFD組與LPS組肝組織IRS1、PI3K表達(dá)、p-IRS1Tyr632/IRS1和 p-PI3KTyr458/PI3K比值則顯著降低（P＜0.01），UCP2表達(dá)顯著升高（P＜0.01）， HFD組與LPS組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　離體實驗：
　　1、氧化損傷產(chǎn)物及能量代謝指標(biāo)變化
　　HFD組、LP

11、S組及H+L組8-OhdG、MDA及4-HNE顯著高于NC組（P＜0.01， P＜0.05），能量代謝指標(biāo)與NC組比較，HFD組、LPS組及H+L組ADP、ATP顯著降低（P＜0.05）。HFD組、LPS組及HFD+LPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2、Western blot結(jié)果
　　與NC組相比， HFD組、LPS組及H+L組肝細(xì)胞IRS1、PI3K表達(dá)、p-IRS1Tyr632/IRS1和p-PI3KTy

12、r458/PI3K比值則顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），UCP2表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，HFD組、LPS組及H+L組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、高果糖飲食及皮下注射LPS可誘發(fā)大鼠胰島素抵抗和代謝性內(nèi)毒素血癥，并伴有氧化應(yīng)激和肝細(xì)胞線粒體功能障礙。
　　2、LPS可誘導(dǎo)氧化中間產(chǎn)物生成增多，清除減少，致使肝臟處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進而破壞肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)，影響其能量代謝，加速胰島素