解郁育胞方對(duì)慢性應(yīng)激大鼠子宮內(nèi)膜容受性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本課題通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究解郁育胞方對(duì)慢性應(yīng)激大鼠子宮內(nèi)膜容受性的干預(yù)作用，并探討其作用機(jī)理。旨在探索臨床不孕患者因生活環(huán)境、不孕本身、或由試管嬰兒（IVF-ET）失敗等造成心理壓力引起子宮內(nèi)膜容受性低下的機(jī)理，為臨床應(yīng)用疏肝養(yǎng)肝法治療不孕證及輔助生殖技術(shù)（ART）的中醫(yī)輔助治療，從而提高受孕成功率，提供理論依據(jù)。
　　方法：本研究以SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）系大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)建立慢性應(yīng)激模型，采用解郁育胞方對(duì)

2、子宮內(nèi)膜容受性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
　　選擇有正常動(dòng)情周期的8周齡SD雌性大鼠納入實(shí)驗(yàn)，進(jìn)入SPF級(jí)屏障系統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，按體重分層法隨機(jī)分為5組，每組16只。包括A組正常對(duì)照組（A正常組），B組模型對(duì)照組(B模型組），C組解郁育胞方低劑量組（C解低組），D組解郁育胞方中劑量組(D解中組)，E組解郁育胞方高劑量組(E解高組)。
　　除A正常組外，其余4組大鼠采用慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激模型造模，接受14日不同應(yīng)激源刺激，包括行動(dòng)受限（

3、2h)、夾尾(1min，3次/日）、冰水游泳(4℃，5min)、噪音(75dB，1h)、禁食（24h）、禁水（24h）、電擊足底（電壓50mV，每隔50s刺激1次，每次持續(xù)10s，共30次）。每日隨機(jī)選擇2種刺激。造模14日后大鼠出現(xiàn)倦怠懶動(dòng)，進(jìn)食興趣降低，修飾行為（抬舉、抓癢、舔足等）減少，提示造模成功。各組持續(xù)刺激至合籠日，共28日。
　　D解中組：于刺激第15日開(kāi)始，每日9:00給予解郁育胞方溶液（相當(dāng)于生藥1g·mL-1）

4、灌胃，按體表面積折算臨床有效劑量，給藥容量為11.2mL·kg-1，每日1次，至處死日。
　　C解低組：于刺激第15日開(kāi)始，每日9:00給予解郁育胞方溶液灌胃，按 D解中組所折算臨床有效劑量的1/2給藥，給藥容量為5.6mL·kg-1，每日1次，至處死日。
　　E解高組：于刺激第15日開(kāi)始，每日9:00給予解郁育胞方溶液灌胃，按D解中組折算臨床有效劑量的2倍給藥，給藥容量為22.4mL·kg-1，每日1次，至處死日。

5、　　A正常組、B模型組于第15日每日9:00灌服臨床有效劑量等體積蒸餾水，容量為11.2mL·kg-1，每日1次，直至處死日。
　　五組大鼠分別于第28日16:00雌雄2:1合籠，次日晨9:00時(shí)檢查陰栓，并進(jìn)行陰道涂片檢查，涂片發(fā)現(xiàn)精子或陰栓者記為妊娠第1日。
　　各組達(dá)到妊娠第4日（處死日）的8只大鼠，于當(dāng)日16：00摘眼球取血3-5mL，30min內(nèi)于1000*g離心15min，取上清液，按使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)β-內(nèi)啡肽（β

6、-EP）含量。取血結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死大鼠，剖取并分離子宮，將子宮內(nèi)膜沿縱軸剖開(kāi)，展平，反復(fù)用生理鹽水沖洗后，取單側(cè)子宮放入4％戊二醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，制成透射電鏡標(biāo)本，觀察子宮內(nèi)膜胞飲突。取另側(cè)子宮分切成上、下2段，上段置于10%多聚甲醛中固定，運(yùn)用免疫組化SP法，檢測(cè)各組大鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)水平；下段子宮取出后立即置于-80℃冰箱保存，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈技術(shù)（Real-TimePolym

7、erase Chain Reaction，RT-PCR)測(cè)HOXA-10mRNA含量。
　　各組剩余8只大鼠于合籠第10日16：00全部頸椎脫臼法處死，剖取子宮，統(tǒng)計(jì)妊娠率和平均胚胎數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠一般情況觀察
　　造模14日后，B模型組和C解低組大鼠出現(xiàn)神態(tài)倦怠，眼目無(wú)神，扎堆懶動(dòng)，造模時(shí)抗?fàn)幉环e極，修飾行為（抬舉、抓癢、舔足等）減少，攝食量減少，大便性狀改變（干結(jié)或稀溏），毛色無(wú)光澤等表現(xiàn)。

8、說(shuō)明應(yīng)激對(duì)大鼠情緒和行為造成了一定的影響。A正常組、D解中組、E解高組毛色光潔整齊，活潑好動(dòng)，眼睛有神，攝食正常，體重上升較迅速。直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組大鼠用藥期間均未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，應(yīng)激結(jié)束后各組大鼠無(wú)死亡。
　　2.各組大鼠動(dòng)情周期變化
　　于造模第15日進(jìn)行陰道涂片，連續(xù)觀察大鼠動(dòng)情周期變化14日。B模型組表現(xiàn)為動(dòng)情周期延長(zhǎng)，主要為動(dòng)情間期延長(zhǎng)，顯微鏡下觀察大量白細(xì)胞、少量有核退化上皮細(xì)胞和黏液出現(xiàn)的時(shí)間延長(zhǎng)。B模型組和

9、C解低組的動(dòng)情周期比A正常組明顯延長(zhǎng)（P<0.05）。D解中組、E解高組與B模型組相比，動(dòng)情周期縮短（P<0.05）；與 A正常組相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。C解低組與E解高組、D解中組相比，動(dòng)情周期有明顯差異（P<0.05）。
　　3.各組大鼠血清β-EP比較
　　B模型組大鼠血清β-EP的含量比A正常對(duì)照組明顯增加（P<0.05），證明造模成功；與A正常組比較，C解低組的β-EP含量明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

10、<0.05）；而D解中組、E解高組與A正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與B模型組比較，解郁育胞方各實(shí)驗(yàn)組（低、中、高三組）的β-EP含量均低于B模型組，均高于A正常組，D解中組、E解高組與B模型組比較有顯著差異（P<0.05），而C解低組與B模型組比較β-EP含量無(wú)明顯差異（P>0.05）；D解中組、E解高組的β-EP含量明顯低于C解低組（P<0.05）。D解中組、E解高組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。4.透射電鏡下各組

11、大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞胞飲突表達(dá)
　　與A正常對(duì)照組相比，B模型組、C解低組、D解中組的胞飲突評(píng)分下降，其中B模型組、C解低組與A正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），D解中組與A正常組無(wú)明顯差異（P>0.05）；而E解高組胞飲突評(píng)分比A正常組略高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與B模型組相比，解郁育胞方各實(shí)驗(yàn)組（低、中、高三組）胞飲突評(píng)分均較 B模型組增高，D解中組、E解高組的胞飲突評(píng)分明顯高于 B模型組（P<0.

12、05）；D解中組、E解高組的胞飲突評(píng)分明顯高于C解低組（P<0.05）；D解中組、E解高組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　5.各組大鼠子宮內(nèi)膜HOXA-10mRNA的表達(dá)
　　子宮內(nèi)膜HOXA-10mRNA含量通過(guò)計(jì)算標(biāo)本HOXA-10mRNA與β-Actin mRNA的比值測(cè)定。HOXA-10mRNA在5組子宮內(nèi)膜和蛻膜組織中均有表達(dá)，A正常組值為0.965±0.102，B模型組為0.6583±0.031，C解低組值

13、為0.7983±0.017，D解中組值為0.8663±0.125，E解高組值為0.8246±0.317。HOXA-10mRNA在不同條件下大鼠子宮內(nèi)膜中的相對(duì)含量顯示，與A正常組相比，B模型組和C解低組HOXA-10mRNA的表達(dá)水平顯著下降（P<0.05)。與B模型組比較，C解低組、D解中組、E解高組的
　　HOXA-10mRNA的表達(dá)水平均顯著提高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。與C解低組比較，D解中組、E解高組的HOXA-1

14、0mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。D解中組、E解高組之間HOXA-10mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　6.各組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF比較
　　VEGF主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和部分基質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿，部分間質(zhì)細(xì)胞亦呈現(xiàn)弱著色，各試驗(yàn)組表達(dá)強(qiáng)弱不一。與A正常組相比，B模型組 VEGF的表達(dá)明顯降低（P<0.05），說(shuō)明慢性應(yīng)激對(duì)大鼠的子宮內(nèi)膜血管生成有抑制作用。解郁育胞方實(shí)驗(yàn)組（低、中、

15、高三組）與正常對(duì)照組 VEGF的表達(dá)相比較差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與 B模型組相比有明顯差異（P<0.05）。解郁育胞方實(shí)驗(yàn)組（低、中、高三組）之間VEGF的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　7.各組大鼠妊娠數(shù)及著床數(shù)比較
　　各組大鼠經(jīng)過(guò)10日合籠，A正常組、D解中組、E解高組均全部妊娠，B模型組和C解低組各有1只大鼠仍未妊娠。與A正常組相比，B模型組與C解低組的大鼠平均著床點(diǎn)數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

16、義（P<0.05)。D解中組和E解高組的平均著床點(diǎn)數(shù)與A正常組無(wú)明顯差異(P>0.05)。與B模型組相比，D解中組和E解高組的平均著床點(diǎn)數(shù)明顯增高（P<0.05)；與C解低組相比，D解中組和E解高組的平均著床點(diǎn)數(shù)明顯增高（P<0.05)；D解中組和E解高組之間的平均著床點(diǎn)數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.B模型組大鼠的行為學(xué)、動(dòng)情周期、血β-EP等指標(biāo)發(fā)生改變，造模成功；
　　2.慢性應(yīng)激能夠?qū)Υ笫笞?/p>

17、宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)指標(biāo)（VEGF、子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞胞飲突、HOXA-10mRNA的表達(dá)）產(chǎn)生影響；
　　3.解郁育胞方能夠改善大鼠的應(yīng)激狀態(tài)（一般狀態(tài)，動(dòng)情周期，血β-EP等）；
　　4.解郁育胞方對(duì)應(yīng)激所造成的子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)胞飲突、VEGF、HOXA-10mRNA表達(dá)具有改善作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性的特點(diǎn)。
　　因此，我們推測(cè)解郁育胞方可能通過(guò)改善大鼠的應(yīng)激狀態(tài)，改善慢性應(yīng)激大鼠子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子的表達(dá)，從而改