大葉蛇葡萄不同器官黃酮類(lèi)化合物代謝路徑差異表達(dá)基因研究.pdf

1、大葉蛇葡萄（Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg）來(lái)源于葡萄科蛇葡萄屬植物，臨床常用于治療高血壓等?，F(xiàn)代研究表明，該植物體內(nèi)含有多種黃酮類(lèi)活性成分，主要為二氫楊梅素（dihydromyricetin）、楊梅苷（myricitrin）、槲皮苷（quercitrin）和楊梅素（myricetin）等。目前在基因水平上對(duì)該植物活性成分的生物合成研究仍然處于空白，不同器官之間活性成分含量差異的分子機(jī)制未見(jiàn)報(bào)

2、道。本研究采用高通量Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)大葉蛇葡萄的葉、花和果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了該植物不同器官中豐富的基因功能注釋信息，同時(shí)基于不同器官之間基因表達(dá)量的差異性，探討相關(guān)功能基因在該植物黃酮類(lèi)化合物生物合成中發(fā)揮的作用。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　(1)采用HPLC技術(shù)同時(shí)測(cè)定了大葉蛇葡萄葉、花和果實(shí)中二氫楊梅素、楊梅苷、槲皮苷和楊梅素共4種黃酮類(lèi)化合物的含量，結(jié)果表明不同器官之間各成分含量存在較大差異。其中，二氫楊梅

3、素在葉和花部位中含量相近，但在果實(shí)中含量相對(duì)較低；楊梅苷在葉中的含量明顯高于花和果實(shí)；槲皮苷和楊梅素在葉和花中含量均較低，而在果實(shí)中均未檢測(cè)出。
　　(2)采用Illumina測(cè)序技術(shù)完成了大葉蛇葡萄葉、花和果實(shí)3個(gè)部位的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)總量超過(guò)15 G。所有樣本有效數(shù)據(jù)的Q20均超過(guò)94％，Q30均超過(guò)89%，通過(guò)數(shù)據(jù)組裝共獲得了48915條Unigene序列，N50長(zhǎng)度達(dá)到1648 bp，平均長(zhǎng)度為888 bp，總

4、體序列較長(zhǎng)，表明測(cè)序和組裝質(zhì)量較好。通過(guò)與Gene ontology、Pfam、eggnog、KEGG ko、TmHMM、SignalP等多個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，總共有67.28%的序列與已報(bào)道的其他物種的基因具有較高同源性，獲得了較全面的功能注釋信息。通過(guò)對(duì)KEGG代謝通路中與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)的基因表達(dá)量分析，初步篩選獲得了不同器官之間與二氫楊梅素、楊梅苷、槲皮苷以及楊梅素生物合成相關(guān)的差異表達(dá)基因，分別為 FLS（黃酮醇合成酶

5、）、F3',5'H（黃酮類(lèi)3',5'-羥化酶）、F3OM（黃酮醇3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）、DFR（二氫黃酮醇4-還原酶）和LAR（無(wú)色花色素還原酶）。
　　(3)在差異表達(dá)基因分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得的不同器官之間的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)FLS、F3',5'H、F3OM、DFR和LAR共5種酶基因進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中篩選出了合適的內(nèi)參基因，同時(shí)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。最后結(jié)合